Sviluppo di un<em> In vitro</em> Sistema modello per studiare l'interazione tra<em> Equus</em><em> Caballus</em> IgE con il suo recettore ad alta affinità FcεRI
Summary
The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.
Abstract
The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (FcεRI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and FcεRI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine FcεRIα was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine α-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat β- and γ-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine FcεRIα transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using β-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% ± 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.
Introduction
Allergia è noto da millenni. Un trattamento di asma è stato descritto nel testo medico egiziano antico noto come il Papiro di Ebers (~ 1550 aC) e discusso i rimedi a base di erbe per il trattamento di essa 7.
Allergia Oggi è classificata come una risposta di ipersensibilità di tipo I, in cui il tipo cellulare T helper 2 (TH 2) braccio del sistema immunitario dirige la produzione di anticorpi immunoglobulina E (IgE) in risposta ad antigeni ambientali chiamati allergeni. Si tratta di sostanze diverse che comunemente interagiscono con le cellule del sistema immunitario e stimolano la sintesi e la secrezione di citochine pro-infiammatorie, comprese interleuchina-4 e interleuchina-13 8, 9 così come particelle in particelle di fumo di sigaretta o di scarico diesel che permettono di migliorare la sintesi di IgE 10.
L'aumento delle manifestazioni allergiche nei paesi industrializzati negli ultimi 50 anni è stata attribuita ad una combinazione dell'effetto diinquinanti ambientali e una tendenza a un ambiente più igienizzato, che si combinano per spostare la risposta immunitaria verso un profilo predominato da TH 2 citochine, come proposto dalla 'ipotesi dell'igiene' 11.
Come accennato in precedenza, gli esseri umani non sono gli unici mammiferi affetti da allergia. In particolare cavalli e cani possono anche sviluppare reazioni allergiche classiche e uno studio di 12 ha dimostrato che, come negli esseri umani, allergia equina è attribuito a fattori genetici e ambientali. Di conseguenza, questi animali presentano un buon modello per studiare l'interazione tra cause genetiche e ambientali di allergia, la sua progressione da sensibilizzazione alla malattia, e le possibili strategie di intervento una volta che le manifestazioni cliniche indicate nel
Nel 1887, Stömmer stato il primo a descrivere la somiglianza tra umano e asma equina 13, l'effetto dell'istamina sul sistema cardiovascolare equina èmolto simile a quello umano 14. I cavalli sono anche la pietra angolare del settore corse di cavalli, che vale la pena di US $ 72 miliardi, con un giro d'affari delle scommesse di US $ 115 miliardi di dollari all'anno 15.
La maggior parte dei cavalli da corsa in stile contemporaneo sono discendenti del piccolo numero di cavalli arabi allevati da Lady Anne Blunt dal 1878 in poi. Cavalli da corsa moderne sono comunemente inbred selezionare per le abilità di performance. Essi sono inclini a malattie genetiche, uno dei quali è la loro suscettibilità a montare reazioni allergiche. Essi hanno anche 1000 volte più elevati livelli di IgE nel siero rispetto anche gli esseri umani più gravemente allergica 16. Reazioni allergiche a cavallo sono di solito manifestano come puntura d'insetto ipersensibilità (IBH) 17, 18. IBH risultati nella dermatite a causa di punture di insetti formano nel genere Culicoides. Un'altra forma di malattia allergica equina è ostruzioni delle vie aeree ricorrenti (RAO), questo si manifesta nei polmoni e le vie respiratorie. E 'caratterizzata da respiro sibilante e laboratoriorespirazione OR. RAO comunemente si verifica in risposta alla muffa spore, e alti livelli di IgE allergene-specifici sono stati registrati nei cavalli affetti da RAO in uno studio di 19 anche se un'altra inchiesta non ha confermato che 20.
Gli studi su allergie equina ruotavano attorno al tentativo di controllo e di neutralizzare equina IgE attraverso lo sviluppo di anticorpi anti-equino IgE monoclonali (MAK, MAB) 21, 22. Inoltre lo studio entro il 23 illustra la produzione dei domini extracellulari di α equina ad alta affinità Fc recettore catena (FcεRIα) recettori nel tentativo di rilevare e quantificare siero equino IgE. Uno studio correlato da Ledin 24 illustra un nuovo approccio volto a neutralizzare il siero IgE dal priming del sistema immunitario con un self / non-self immunogeno. Tutti questi studi, tuttavia, non avevano un test efficace per testare la sicurezza e l'efficacia dei loro protocolli. In questo articolo, presentiamo ora tale prova sysTEM applicabile allo studio di strategie diagnostiche e terapeutiche relative al sistema equina, dove rilascio β-dell'esoaminossidasi, come indicatore di mediatore degranulazione delle cellule, è stata valutata su cellule RBL-2H3.1 esprimono equina FcεRIα. Questo protocollo si basa su precedenti pubblicazioni 25, 4, 5, 2, 3 descrivono l'ingegnerizzazione di cellule RBL trasfettate con il gene codificante il dominio di legame del recettore IgE ad alta affinità per le IgE da specie diverse. Il protocollo descritto come eseguire un saggio di rilascio β-dell'esoaminossidasi, i cui risultati sono presentati come media ± deviazione standard di esperimenti in triplo.
Il saggio di rilascio è stato sviluppato da Siraganian e gancio 25 per studiare l'allergia umana. Il gruppo del laboratorio guidato dal dottor Reuben Siraganian ha sviluppato anche la linea di cellule RBL. Queste cellule RBL sono stati sviluppati per esprimere la FcεRIα umana e il protocollo è stato pubblicato da 4. Il pezzo finaledel dosaggio venuto con lo sviluppo del plasmide pSV nel lavoro di Neuberger 26 che descrive la produzione di un anticorpi IgE clonando suo pesante gene della catena a valle di un gene del mouse per una regione variabile di IgE che gli obiettivi l'aptene 4-idrossi-3 nitro-phenacetyl (NP), l'anticorpo chimerico risultante era perfettamente funzionante. La possibilità di sviluppare qualsiasi IgE rivolti stesso aptene, ma anche di clonazione suo recettore sulla superficie delle cellule RBL portato alla normalizzazione del dosaggio rendendolo un protocollo utile per misurare la degranulazione dei basofili.
Il test ha i pro e contro. I pro del saggio è la sua adattabilità ad essere utilizzato in qualsiasi sistema di mammiferi, il nostro laboratorio ha quindi utilizzato per verificare la degranulazione dei sistemi umani, canini e equino, e questo è realizzabile semplicemente sintetizzando IgE dell'organismo e la clonazione suo recettore sulla superficie delle cellule RBL.
D'altronde,i contro del saggio è che le cellule RBL sono molto sensibili alle variazioni termiche, meccaniche e PH, rendendoli dare una variazione dei livelli di degranulazione all'interno dello stesso dosaggio. E 'quindi fortemente consigliato che i dosaggi vengano sempre ripetuti in triplicato e quindi una media è preso da loro. Inoltre, le cellule RBL tendono a spostarsi verso un fenotipo non-rilascio se lasciati in coltura per un tempo prolungati (> 10 settimane) 27, rendendo la loro manutenzione ingombrante. Sono anche soggetti a infezioni da batteri micoplasma, che non sono visibili al microscopio ottico e non modificano la morfologia della cellula, ma sarebbero drasticamente cambiare i loro livelli di degranulazione. Pertanto sono necessari test micoplasma regolari.
Protocol
Representative Results
Discussion
In sintesi i risultati di questa indagine hanno dimostrato che quando le cellule RBL-2H3.1 esprimono FcεRIα equini sono sensibilizzati con equina IgE e contestate da un antigene, danno un rilascio picco mediatore del 36.68% ± 4,88% del totale di mediatore all'interno della cellule, rispetto alla RBL-2H3.1 cellule parentali non esprimono equina FcεRIα.
Così questo test fornisce un utile strumento per indagare e studiare le risposte allergiche equini in vitro. La sua consent…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Lynda Partridge for the provision of advice and laboratory facilities.
Materials
| RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα | – | – | Produced in the lab |
| Equine IgE anti NIP-HSA | – | – | Produced in the lab |
| 96 Well Plate | Sigma | CLS3595 | – |
| Multi Channel Pipette | Anachem | – | – |
| Incubator | Galaxy R | – | – |
| 4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab |
| Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin | Sigma | A6661 | Abbreviated DNP-HSA |
| Plate Spectrophotometer | Anthos Labtec HT2 | – | – |
| Pipes | Sigma | P1851 | – |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | – |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | – |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | – |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | – |
| Triton x100 | Sigma | X100 | – |
| 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | N9376 | Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | – |
| Citric Acid | Sigma | 251275 | – |
| Sodium Acetate | Sigma | S7670 | – |
| Tris | Sigma | T5941 | – |
Riferimenti
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