Изоляция Кишечныеинфекции стволовых клеток из взрослых<em> Drosophila</em> Midguts по FACS для изучения стволовых клеток Поведение в процессе старения

Summary

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

Abstract

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells’ (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

Introduction

Неизбежным следствием старения является уменьшение способности тканей и органов оставаться функциональным. Взрослые стволовые клетки необходимы для поддержания гомеостаза тканей и функциональность органов, однако, как организмы возраст, стволовые клетки также испытывают снижение их биологическое поведение. Это особенно вредно для тканей, которые имеют высокую скорость оборота, например, в кишечном эпителии. Клейма в возрасте стволовых клеток включают геномной повреждения, нарушение механизмов ремонта, регуляции клеточного цикла нарушение и misregulated сигнальных путей, каждый из которых влияют на нормальное поведение стволовых клеток (обзор в ^1-3). Манипулируя конкретные сигнальные пути или стучать вниз специфических генов, мы получили представление о своей роли в регулировании и поддержании нормального поведения стволовых клеток. Поскольку большинство из этих экспериментов являются кандидатами подходы молекулы, у нас очень мало знают о эндогенных молекулярных изменений, которые происходят в стволовых клетках во времястарения. Один из способов подойти к этому вопросу заключается в сравнении транскриптома молодой по сравнению с старые стволовые клетки для идентификации молекул, чья экспрессия профиль существенно меняется в процессе старения. К сожалению, биологические и технические проблемы мешали нашему прогрессу в отношении этого подхода до сих пор.

Дрозофилы является очень удобной моделью организм изучения старения, поскольку он имеет короткий срок службы (около 60-70 дней) и экспонаты старения фенотипы (обзор в ^4). Кроме того, процесс старения у дрозофилы может быть ускорен путем температуре. При хранении мух при 29 ° С, в возрасте фенотип в ткани кишечника можно наблюдать уже через 15 дней ^5. Кроме того, Drosophila поддается для множества генетических манипуляций. В частности, средняя кишка Drosophila стала отличная модель системы для изучения влияния различных сигнальных путей и экологических проблем набиология кишечных стволовых клеток (ISCS) в процессе старения (обзор в ^6-10). Drosophila кишечного эпителия имеет высокую скорость оборота и обновляется каждые две недели у женщин и примерно раз в месяц у мужчин ^11. ISCs проживающих в средней кишке Drosophila обладают способностью к делению и производить самостоятельно обновляется ISC и постмитотические клеток-предшественников под названием enteroblast (EB) ^12,13. EB дифференцируется в любом поглощающей энтероците или секреторной энтероэндокринные клетки. К этой дате, только сочетание маркер, который однозначно этикетки в ISC является выражение фактора транскрипции улиток (ESG) и Notch лиганда Delta (DL) ^14. Однако, это только справедливо и для молодого и здорового кишечника. В процессе старения, кишка эпителий характеризуется увеличением ISC пролиферации ^15-17. Кроме того, аберрантная сигнализации Notch нарушает решение судьбы ISC дочерних клетоки индуцирует misdifferentiation ЭТ ^15. Это приводит к накоплению клеток, которые являются активными для сигнализации Notch и совместно экспресс ESG и DL, тем самым делая Dl выражение достаточным для идентификации добросовестных стволовых клеток в возрасте кишки. Трудности в определении истинных ISCs препятствует способности, чтобы изучить эндогенные изменения в процессе старения ISCs до сих пор.

Мы решили эту проблему, воспользовавшись ESG -Gal4, UAS-GFP трансгенных мух линии, в которых уровень GFP выражение в ISCs и ЭТ по своей сути разные, и остается отличным всей старения. Аналогичный подход был описан для изоляции личинок нейробластах и нейронов ^18,19. Midguts молодых и старых ESG -Gal4, UA-GFP мух были вскрыты и диссоциированных на одиночные клетки. Затем клетки сортируют по GFP-положительных клеток с помощью сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS). Интересно, сортируются GFP-положительных слоктей разделены на две ярко выраженных пиков на основе интенсивности флуоресценции GFP (GFP ^{высокой} и GFP ^ниже). Кроме того, распределение GFP-положительных клеток в двух пиков также коррелирует с размером ячейки: клетки, которые выставлены низкой интенсивности GFP были маленькими и менее зернистой тогда как клетки с высокой интенсивностью GFP были больше и больше гранулированный. Это наблюдение предположить, что меньшие ISCs можно отличить от более крупных ЭТ с использованием FACS на основе интенсивности GFP и выбрать наиболее подходящий рассеяния вперед (FSC) и боковое рассеивание (SSC) установки. Интересно, что два пика оставалась отчетливо разделены во старения. Кроме того, соотношение двух пиков изменяется таким образом, что отражает вышеуказанные признаки старения midguts: а именно, что количество велико, misdifferentiated EBS увеличивается с течением времени. Исходя из этих данных можно заключить, что при сортировке по GFP-позитивных клеток, используя соответствующие настройки параметров FACS мы можем обогатить для ISCs и ЭТ в любой момент времени Dтором старения.

Таким образом, мы вводим стратегию FACS, что позволяет исследователям для обогащения двух различных клеточных популяций, ISCs и EBS, от дрозофилы midguts любого возраста и изолировать эти клетки для дальнейшего анализа, такие как следующего поколения секвенирования. Этот мощный метод позволяет изучать эндогенных молекулярных механизмов, которые присущи старения в обогащенной населения стволовых или прогениторных клеток. Полученные в этих исследованиях данные, несомненно, будут способствовать выявлению консервативных молекул, которые имеют существенное значение в процессе старения у разных видов.

Protocol

Примечание: Если этот протокол используется в первый раз, чтобы изолировать от ISCS ВСК сортировка, следующие элементы управления являются обязательными для того, чтобы первоначально установить параметры FACS образом: Диссоциированные клетки от дикого типа (например, W 1118) Drosophila midguts без Sytox. Диссоциированные клетки дикого типа (например, W 1118) Drosophila midguts с Sytox (см Шаг 3,6). Диссоциированные клетки midguts ЭСУ -Gal4, UAS-GFP мух линии без Sytox. 1. Приготовление растворов и блюда для Gut Вскрытие Подготовка 4-6 флаконов каждая из которых содержит 40 женского мух от ESG -Gal4, UAS-GFP муха линии. С 10х PBS раствора подготовить 500 мл 1x PBS (1,8 мМ NaH 2 PO 4 · H 2 O, 8,4 мМ Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 175 мм NaCl, доведения рН до 7,4). Подготовьте 3,5% -ный Раствор агарозы в 1x PBS (3,5 г электрофореза в агарозном оценка в 100 мл 1х PBS). Подготовка рассечение пластины при заливке это решение в чашках Петри (диаметр 8,5 см), чтобы покрыть дно. Агарозном слой предотвращает повреждения кончики щипцов во время процедуры вскрытия. После гель затвердевает хранения рассечение пластины при 4 ° С. Подготовьте 300 мл 1X PBS + 1% BSA свежие до вскрытия и поместить бутылку на льду или при 4 ° С. Включите центрифуги и дайте ему остыть до 4 ° C. Пламя кончики 2 стекла пипетки Пастера, чтобы сгладить края. Чистые две пары щипцов и один лезвие бритвы 70% -ным этанолом. Поместите 5:56 1,5 мл микроцентрифужных пробирок для сбора расчлененные midguts на льду. 2. Подготовка желудочно-кишечного тракта и рассечение кишки Обезболить мух от одного флакона (40 мух) с СО 2 на стандартном лету кровати, обезглавить вселетит с помощью лезвия бритвы и передавать их на рассечение блюдо. Залить холодной 1X PBS / 1% BSA решение в рассечение блюдо, чтобы покрыть агарозном геле. Мухи и поплывет. Возьмите летать живота с одной парой щипцов, удерживая грудную клетку с другой парой щипцов. Отделите грудную клетку от брюшной полости. Кишки будут видны и передней кишки / культур, скорее всего, все еще подключен к грудной клетке. Возьмите кишки и вытащить его из грудной клетки. Чтобы разложить кишечник, возьмите урожай и тянуть в кишечнике немного вперед от брюшной полости. Захват задний конец брюшка с одной парой щипцов и края открытой кпереди кутикулы с другой парой щипцов. Будьте осторожны, чтобы не разрушить выступающий ткани кишечника. Потяните конец задней прочь нарушить кутикулу и продолжайте тянуть сзади очень мягко, пока вся кишка не была вытащил из брюшной полости. Культура, возможно, придется быть удалены заранее, если он слишком большой, чтобы соответствоватьчерез полость тела. Снимите передней кишки, мальпигиевых, кишку и яичники, оставляя голый среднюю кишку. Использование стекла пипетки Пастера, передать партию рассеченных midguts к 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую холодной 1X PBS / 1% раствора BSA, и держать трубку на льду. Образцы должны быть обработаны в течение 2 ч. После рассечения весь пакет завершения, промыть рассечение блюдо с дважды дистиллированной водой смыть перенесенный мусора. Начните рассечения следующую партию midguts (Повторите этапы 2.1-2.7). Проанализируйте, как много партий, как это возможно в пределах 2 ч, затем перейдите к шагу 3.1. 3. Расщепление ткани кишечника, чтобы собрать клетки для КВС Сортировка Удалить 1X PBS / 1% BSA решение от midguts и добавить 500 мкл 0,5% раствора трипсина-ЭДТА в каждом образце. Вихревой и в течение 20 сек и инкубировать образцов при осторожном качания / вращающихся при 20 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 25-30 мин. Вихревой снова после приблизительно 30 минут, и пусть интактный раковина кишки ткани на дно пробирки. Осторожно снимите клетки, которые находятся в суспензии с волнистого стекла пипетки Пастера и фильтровать их через 35 мкм нейлоновой сеткой в ​​свежем 1,5 трубки микроцентрифужных мл. Спин клетки вниз на 100 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Следует отметить, что при запуске дайджест, осадок клеток, возможно, не будет видно на первый, но станет видно, как ткани дайджест прогрессирует. Тщательно передачи раствором трипсина, обратно в исходное пробирку, содержащую интактными кишки ткани. Во избежание передачи слишком много клеток из осадка. Аккуратно повторно приостанавливать осадок клеток в 400 мкл холодного 1x PBS / 1% BSA. Держите микроцентрифужных пробирок, содержащих разложенных клеток на льду и покрыть трубы с алюминиевой фольгой для защиты клеток от света. Vortex решение трипсин снова, содержащий малонарушенных кишки ткани и поместите образцына качалке в течение еще 30 мин при комнатной температуре. Повторите шаги 3.3 до 3.4.3, пока все средней кишки ткани не переваривается. Объедините разложенных клеток из всех микропробирок в одну пробирку микроцентрифужных. Это может потребовать шаг центрифугированием, как в 3,4, так как объем всех клеточных суспензий в сочетании может превышать 1,5 мл. Хранить клеточной суспензии на льду и защищают клетки от света. Спин диссоциированных клеток вниз на 100 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Осторожно удалить как можно больше супернатант насколько это возможно оставляя приблизительно 50-100 мкл в 1X PBS / 1% раствора BSA в микроцентрифужных трубки. Осторожно ресуспендирования диссоциированных клеток в 800 мкл 1X PBS / 1% BSA, содержащем Sytox (1: 20000). Передача клеточной суспензии в 5 мл круглодонную нижнюю трубки сокола путем фильтрации клетки через ячейки сетчатого фильтра оснастки крышкой (нейлон сетки 35 мкм). Всегда держать образцы клеток на льду и защищенном от света месте. Клетки теперь готовыбыть отсортированы. Пипетировать 600 мкл раствора в каждую RNAlater микроцентрифужных трубки, в которую клетки будут отсортированы для последующего выделения РНК. Для других приложений вниз по течению клетки могут быть собраны в другом растворе, например в стерильном PBS. 4. FAC Сортировка изолировать Кишечныеинфекции стволовых клеток Включите цитометрии прямого потока по меньшей мере, один час до сортировки. Убедитесь, что жидкостный система свободна от пузырьков воздуха. Выбор размера сопла 70 мкм, чтобы ввести в клетки в поток оболочки жидкости. Регулировка амплитуды потока основной текучей среды таким образом, чтобы значение зазора соответствует эталонного значения (6-7, при использовании насадки 70 мкм). Пусть поток жидкое ядро ​​стабилизации, прежде чем начать сортировать. Следуйте этот порядок, если первоначальная настройка параметров для сортировки: Загрузите разложенных клеток, полученных от диких кишок типа. Во-первых, регулировать напряжение FSC и SSCдля построения клеток в центре диаграммы рассеяния. Во-вторых, регулировать напряжение FITC (GFP), так что все клетки нанесены ниже 10 2 на логарифмической оси х. Установка параметра FITC устанавливает предел для флуоресценции. Загрузите Диссоциированные клетки, полученные от диких кишок типа с Sytox добавил. Установите значение Pacific Blue напряжения и ворота для идентификации и отдельной гостиной клетки от мертвых, Sytox-позитивных клеток в Pacific Blue против FSC-точечный график. Загрузите разложенных клеток, полученных из ESG -Gal4, UAS-GFP мух линии без Sytox и регулировать напряжение FITC, чтобы убедиться, что все GFP-позитивные клетки построены в диаграммы рассеяния. Загрузите разложенных клеток, полученных из ESG -Gal4, UAS-GFP муха линия с Sytox добавил. Установите значение Pacific Blue напряжения и ворота для идентификации и отдельной гостиной клетки от мертвых, Sytox-позитивных клеток (ворота P1). Установите SSC-А и FSC-ворота, чтобы определить GFP-позитивные клетки (на основе гистограммы), как определено по размеру и степени детализации (ворота Р2). Установите ворота FSC-H и FSC-W определить и исключить GFP-положительных дублеты клеток в зависимости от их размера (ворота P3). Установите SSC-H и SSC-W ворота определить и исключить GFP-положительных дублеты клеток в зависимости от их детализации (ворота P4). Используйте ворота P4 изобразить GFP-позитивных клеток в гистограммы, которая показывает количество клеток (счет) от интенсивности GFP. Две различные пики GFP-положительных клеток будет видно. Создать ворота для каждого пика (ворота P5 и P6). Ворота Р5 содержит клеточной популяции, которая обогащена ISCS и могут быть отсортированы отдельно от клеток в затворе P6. Вернуться ворота на участке контура, чтобы убедиться, что два различных GFP-положительных клеточных популяций содержат живые клетки (сравнить с ворот P1) и клетки нужного размера (сравните с ворот Р2). Сортировать клеток в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку с 600 & #181; л раствора RNAlater. Сортировка делается на низкой скорости потока (макс. 2,0, 70 мкм сопла, 1000 события / сек, 70 фунтов на квадратный дюйм) и используя то чистоты двусторонний. После сортировки будет завершена, немедленно вихрь отсортированные клетки коротко и не держать микроцентрифужных пробирок на льду, пока идет с выделением РНК или других последующих применений.

Representative Results

Для получения между 50,000-100,000 клеток из КВС сортировки, между 160 и 200 midguts должны быть расчленены. Очевидно, что это является наиболее трудоемким стадию всей процедуры. Мультипликационный показано на фиг.1А показаны основные этапы кишки вскрытия, которые подробно описаны в протоколе, представленной здесь. Эта процедура может быть индивидуально изменен. Рассеченные, весь желудочно-кишечный тракт показан на рисунке 1В. Когда все средней кишки ткани была переваривается, сразу же продолжить FAC сортировки. Следуя стратегии стробирования описано в протоколе позволяет успешной идентификации и сортировки клеточной популяции, обогащенной ISCs и ЭТ из молодых (рис 2) и из старых midguts (рисунок 3). P1 ворота устанавливается включать только здоровые живые клетки и ворота из мертвых клеток. Клетки, которые прокладку на выше 10 3 на логарифмической у топоромэто когда с помощью Pacific Blue канала определяется как мертвых клеток. Точки, что участок ниже 40 на оси абсцисс (FSC-А) в основном мусора и, следовательно, также исключены (фиг.2А). В разброса участок SSC-А против FSC-A клетки распределены в зависимости от их размера и детализации. Для оптимального разрешения, клетки помещают в диаграммы разброса, как показано на фиг.2В, регулируя фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) напряжения. В разброс участков FSC-H по сравнению с ЛПС-З ​​и SSC-H по сравнению с ССК-З отдельные клетки отделены от агрегатов и дублетов в зависимости от размера (фиг.2С) и на основе детализации (рис 2D). При изображении клетки, включенные в ворота P4 в гистограммы, четкое разделение GFP-отрицательный, GFP низкой (ворота P5) и GFP высоких (ворота P6) клеток видна (рис 2E). Клетки, проявляющие меньшую интенсивность GFP малы и менее гранулированный и представляют ISCs. Клетки, обладающие большей GFP Intensity больше и больше гранулированный и представляют EBS. Обратной транскриптазы (RT) -PCR для Dl на кДНК из РНК, синтезированной из клеток каждого GFP-положительных населения (ворота P5, P6) показал, что сигнал Dl действительно сильнее в меньших, GFP низких, чем в клетках больше, GFP высокого клетки (фиг 2H). Затем клетки backgated и изображено на контурных графиков, чтобы подтвердить, что GFP с низким (ворота Р5) и GFP высокой (ворота Р6) клетки различаются по размеру и степени детализации (фиг 2f) и до сих пор живы (рис 2G). Следует отметить, что два пика GFP-позитивных клеток (GFP низким и GFP высокий) может быть только хорошо отмеченным, если (GFP) канал FITC был откалиброван должным образом, используя элементы управления, описанные в протоколе. Та же самая стратегия стробирования был использован при сортировке ISCs, полученные от старых кишки (рисунок 3). Разброс участков (фигуре 3A-D), гистограмма (рис 3E) и контурные графики (рис 3F, G), аналогичны показанным на фиг.2. Как упоминалось выше, нет добросовестные маркера для идентификации ISCS в старых midguts и, следовательно, нет данных RT-PCR представлена ​​здесь. Тем не менее, интригующее наблюдение здесь является то, что два пика, содержащие GFP низкий (ворота P5) или GFP высокие (ворота P6) клетки остаются четко отделен в процессе старения. Кроме того, число клеток в высокой (P6) затвора пика GFP значительно увеличивает время старения, в котором четко имитирует известное накопление misdifferentiated ЭТ с возрастом. Изменение в соотношении двух клеточных популяций можно также рассматривать в разброс участков (сравните фиг.3А-D с фиг.2а-D) и в контурных графиков (сравните фиг 3F, G с фиг 2F, G). Исходя из этих данных можно заключить, что сортировка GFP-положительных клетки с помощью FACS мы можем обогатить для ISCs и ЭТ у молодых и старых midguts. Чтобы проверить чистоту выделенной ISCs и EBS, после анализа своего рода был проведен (рисунок 4). Гистограмма пост отсортированы ISCs и ЭТ (рис 4, б) изображают чистоты между 95% и 98%. Если иерархия установки параметров FACS, как описано выше, строго следовали, два различных клеточных популяций (GFP низкий, небольшой и GFP высокой, больше), уже можно выделить диаграммы рассеяния GFP против ФСБ-A (фиг.5А). Эти две популяции клеток не может быть отмеченным, если эта иерархия не учитывается (рис 5B-D). Рисунок 1: () схема основных этапов Диссеcting мухи кишечник. Во-первых, глава удаляется (удаление крыльев является необязательным) с последующим разделением на грудной клетке и брюшной полости, чтобы обнажить кишечник. Кишки затем освобождают от полости тела в следующих шагов. Черные стрелки показывают прогрессирование вскрытия, в то время как темно-красные стрелки обозначают направление выталкивания. Красные линии в последнем изображении указывают передней и задней границы кишки. (B) световой микроскоп образ взрослой мухи кишечника. Основные регионы и анатомические особенности помечены. Красные линии обозначают границы кишки. Рисунок 2:. FAC сортировки стратегию для выявления и локализации ISCs и ЭТ из молодых (7 дней) midguts Для лучшей визуализации, клетки, представляющие ISCs выделены красным цветом и клетки, представляющие ЭТ выделеныв синем в разброс участков (AD) и в контурных графиков (F, G). () P1 ворота устанавливается, чтобы исключить мертвые, Sytox-положительных клеток на графике выше 10 3 на логарифмической оси ординат. Порог FSC-A установлен в 40 также исключает мертвые клетки и мусор. (B) Клетки закрытого для FSC-A и SSC-А, чтобы выбрать ячейки в зависимости от размера и детализации (ворота P2). Гистограммы (E) был использован параллельно определить GFP-позитивных клеток в FSC-A против SSC-точечный график (B). (C, D) разброс участков FSC-H против FSC-W и SSC-H по сравнению с ССК-З служат для удаления агрегатов и дублеты и выбора для синглетов (P3 затвора в C и ворота P4 в D). (Е) Гистограмма График показывает количество клеток и их интенсивности GFP. Два пика, GFP низкий (ворота P5) и GFP высокий (ворота P6) можно выделить. (F, G) Клетки назад закрытого на участке контура, чтобы убедиться, что два различных GFP-позитивных клеток populatИоны правильного размера (F) и содержат живые клетки (G). (H) обратной транскриптазы (RT) -PCR для Dl на кДНК, синтезированного из РНК, выделенной из клеток, находящихся в первом пике (ворота P5), и в Второй пик (ворота Р6), соответственно. Более Dl выражение может быть обнаружен в клетках, присутствующих в затворе P5 против затвора P6. Tubulin служил управления загрузкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 3: FAC сортировки стратегию для выявления и локализации ISCs и ЭТ от старого (60 дней) midguts Для лучшей визуализации, клетки, представляющие ISCs выделены красным цветом и клетки, представляющие ЭТ выделены синим цветом в разброс участков (AD) и в. контурные графики (F, G). (А) Р1 затвора установлен, чтобы исключить мертвые, Sytox-позитивные клетки нанесены выше 10 3 на логарифмической оси у. Порог FSC-A установлен в 40 также исключает мертвые клетки и мусор. Следует отметить, что увеличение зависимости от возраста в больших GFP-положительных клеток уже очевидно, в этом участке. (B) Клетки закрытого для FSC-A и SSC-A для выбора ячейки в соответствии с размером и степенью детализации (P2) затвора. Гистограммы (E) был использован параллельно определить GFP-позитивных клеток в FSC-A против SSC-точечный график (B). (C, D) разброс участков FSC-H против FSC-W и SSC-H по сравнению с ССК-З служат для удаления агрегатов и дублеты и выбора для синглетов (P3 затвора в C и ворота P4 в D). (Е) Гистограмма График показывает количество клеток и их интенсивности GFP. Два пика, GFP низкий (ворота P5) и GFP высокий (ворота P6) можно выделить. Следует отметить, что высокие GFP клеточной популяции, содержащей более крупные клетки увеличилась IN Количество процессе старения. (F, G) Клетки назад закрытого на участке контура, чтобы убедиться, что два различных GFP-положительных клеточных популяций являются правильного размера (F) и содержат живые клетки (G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4:. Анализ сообщению Сортировать была проведена для определения чистоты выделенной ISCs и ЭТ () GFP-положительных клеток от молодых (7 дней) и старый (60 дней) midguts были FAC сортируются и Гистограмма показывает их распределение на два пика на основе интенсивности GFP. (B) анализ сообщению Сортировать демонстрирует чистоту изолированных ISCs от молодых и старых midguts который является> 97%. (C) анализ после сортировки отсортированных EBs от молодых и старых midguts показывает чистоту> 95%. Небольшие примеси могут возникнуть в результате тушения флуоресценции или механически поврежденных GFP экспрессирующих клеток, вызванных повторно для сортировки клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 5: Примеры графиков рассеяния, которые показывают, неоптимальные данные FACS, что видно, когда параметры FACS не были установлены должным образом () Представитель FACS профиль всех клеток, когда параметры FACS были установлены правильно на основе настроек, описанных в протоколе.. Клеточная популяция, содержащая ISCs отмечена красным и клеточная популяция, содержащая ЭТ является кружили в синем. Клетки зелёный мертвые клетки, которые имеют сильную аутофлуоресценцию по сравнению сживые клетки, которые приведены ниже 10 3 на логарифмической оси у. (Б) Разброс участок изображает типичный результат, полученный, когда прибор FACS не был откалиброван. Нет GFP-позитивные клетки не обнаруживаются. (C) Если FSC не установлен должным образом, различные GFP-положительных клеточных популяций не обнаружено. (D) Если (GFP) канал FITC отрегулирован неправильно, большинство GFP- позитивные клетки должны быть отсортированы не нанесены на график рассеяния, а по верхнему краю участка. Кроме того, на участке, показанном здесь, предел флуоресценции не было регулировать, следовательно, клетки, что участок выше 10 2 на логарифмических у-оси на самом деле autofluorescent и может быть ошибочно, как GFP-положительных клеток.

Discussion

The presented protocol describes a method to isolate ISCs from young and old adult Drosophila midguts, which can subsequently be used for further molecular analyses such as next generation sequencing. FAC sorting of the GFP-positive cell population from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line has already been achieved by several groups^21,22. However, until now the presence of the two distinct peaks of GFP-positive cells has been either overlooked or undervalued. We show that this separation not only represents two different populations of cell types (ISCs and EBs), but also that the two peaks of GFP-positive cells stay distinctly separate during aging. This observation is highly relevant and valuable to researchers interested in studying stem or progenitor cells during aging. Isolation of ISCs from old midguts has been hampered by the fact that there is no molecular marker combination to identify ISCs in an aged midgut. The only marker that unambiguously identifies ISCs in an old midgut is phospho-histone3 (PH3), since ISCs are the only dividing cells in the midgut^12,13. However, PH3 is an unsuitable marker to isolate ISCs since the number of dividing stem cells at any given time point is too low in order to obtain a decent amount of ISCs for subsequent analyses. The fly line esg-Gal4, UAS-GFP is the most common fly line used by researchers who study ISC function, maintenance and differentiation. Our current knowledge on the molecular regulation of ISCs homeostasis is based on studies in which specific molecules and signaling pathways have been manipulated (reviewed in ⁷). Hence, we still lack knowledge about the endogenous molecular changes that occur during aging. The herein described method closes this gap and is based on the fact that ISCs can be isolated based on their size, granularity and GFP intensity from adult midguts at any time point during aging.

While establishing and optimizing this method we have found the following steps to be critical for a reliable outcome. Approximately 200 guts need to be dissected in order to obtain a good amount of ISCs for FAC sorting. The speed of dissection is crucial and depends on the individual’s practice. A trained individual can dissect 40 guts within 20–30 min. Since GFP is also expressed in the Malpighian tubules in the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, it is essential to completely remove the Malpighian tubules from the midgut. The dissected midguts must be kept in a cool environment to avoid tissue degradation and reduce RNAse activity in the tissue. Therefore, the dissected midguts must be transferred from the dissecting dish into microcentrifuge tubes containing cold 1x PBS/1% BSA solution after a maximum of 20-30 min and kept on ice. However, the dissected midguts should not be left on ice for more than 2 hr before starting the tissue dissociation with trypsin. The most efficient approach is to dissect as many batches of flies as possible within these 2 hr, then start the trypsin digest for these batches. If more midguts are needed, they can be dissected during the incubation times of the trypsin digest.

Although trypsin is a very potent enzyme and could have detrimental effects on cells, we still obtained enough living, healthy cells for subsequent FAC sorting. The key step of our procedure that allows for the isolation of intact cells is that the dissociated cells are removed from the trypsin solution every 30 min. If the dissected midguts are incubated for 2 ½ hr in a trypsin containing solution at room temperature, we observed a 20–30% increase in dead, Sytox-positive cells. It should be pointed out that the trypsin solution we use contains EDTA. The presence of EDTA probably facilitates tissue disintegration by chelating calcium and magnesium ions needed for the proper function of extracellular matrix molecules.

The most crucial steps to successfully sort ISCs from young and old guts are the appropriate initial settings of the FACS and gating parameters using the described controls and following a specific sorting hierarchy. We performed the FAC sorting on an ARIA II Flow Cytometer (FACSDiva software). It is important that the instrument is turned on at least one hour prior to sorting to warm up the lasers. Of note, when FAC sorting of ISCs is performed for the first time, the parameters for sorting and for compensation need to be set using the aforementioned controls: (1) dissociated cells from wild type (e.g. w¹¹¹⁸) Drosophila midguts without addition of Sytox — setting this parameter (Step 4.4.1) prevents sorting cells based on their autofluorescence; (2) dissociated cells from wild type (e.g. w¹¹¹⁸) Drosophila midguts with Sytox added — setting this parameter (Step 4.4.2) allows separating dead from living cells (dead cells have a high autofluorescence and can contaminate the sorted GFP-positive cells); (3) dissociated cells from midguts of the esg-Gal4, UAS-GFP fly line without Sytox — setting this parameter (Step 4.4.3) ensures that all GFP-positive cells are plotted within the scatter plot. If these parameters are not set properly, the sorted cell population will most likely contain dead cells and debris (Figure 5B, C), many GFP-positive cells will be missed (Figure 5D) and the two distinct peaks for GFP-positive cells as seen in the histogram plot (Figure 2E and Figure 3E) will not be detected. Once the FACS and gating parameters have been set, the instrument is calibrated and ready to sort cells from the esg-GAL4, UAS-GFP fly line. Since these parameters can be saved, all future sorting sessions for ISCs and EBs from the esg-GAL4, UAS-GFP fly line can start from Step 4.5. Although choosing the “Purity” mode and performing a two-way purity sort decreases the number of cells sorted, it allows for a higher sorting stringency (Step 4.6 and Figure 4B, C). Of note, the advantage of using Sytox instead of propidium iodide to label dead cells is that there is only a low spillover into the FITC (GFP) channel, which makes it easy to compensate for the spillover.

Our method of enriching for ISCs and EBs, respectively, is based on sorting the cells according to different GFP expression levels. It may be that during aging the misdifferentiated EBs also express GFP at a lower level and could be mistaken as ISCs. However, since the sorted cells also differ in size and granularity, we believe that our sorting strategy is the most suitable to this date to enrich for ISCs and EBs. Also, it is known that cells in an aging midgut retaining ISC identity have a small nucleus¹⁵. To obtain more clarity on the identity of the sorted cells, one could sort cells from a transgenic fly line that carries esg-GAL4, UAS-GFP and a Notch signaling reporter transgene. Since Notch has been shown to be active only in the EBs^12,13, ISCs isolated from a young midgut would be negative for the Notch reporter, whereas the EBs would be positive for the Notch reporter. However, during aging Notch signaling becomes aberrant in the midgut tissue. Therefore, it needs to be tested whether this experimental set up is indeed more reliable to distinguish between ISCs and EBs isolated from an old midgut.

We have already employed this approach for comparative transcriptome analysis of ISCs from young and old midguts and identified a number of factors that are differentially regulated during aging (unpub. observ.). Additionally, this method allows for analyzing differences in gene expression between ISCs and the EBs. Such investigations will provide insight into the initial molecular changes that occur as a cell enters the differentiation process. Also, the isolation of EBs during aging and subsequent analyses will shed light on the molecular changes of age-induced misdifferentiation. Furthermore, this method can be combined with other genetic tools used in Drosophila to study gene function. In summary, this method offers an unbiased approach to investigate molecular characteristics and changes of ISCs and EBs during aging. This is a valuable tool that will facilitate exploration of aging mechanisms in adult stem and progenitor cells.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	other solutions, e.g. Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting