Быстрое Фракционирование и выделение целых компонентов крови в образцах, полученных из Окружение сообщества, основанного
Summary
We outline a methodology for the processing of whole blood to obtain a variety of components for further analysis. We have optimized a streamlined protocol that enables rapid, high-throughput simultaneous processing of whole blood samples in a non-clinical setting.
Abstract
Сбор и обработка образцов цельной крови в не-клинической предлагает уникальную возможность оценить общинных жилых лиц, так и без существовавшие ранее условиях. Быстрая обработка этих образцов необходимо избежать деградации ключевых клеточных компонентов. Сюда относятся методы для одновременного периферической крови мононуклеаров клетки (РВМС), ДНК, РНК и изоляция сыворотки от одного взятия крови выполняется в домах по обоюдному согласию участников по столичной области, с обработкой начато в течение 2 ч сбора. Мы использовали эти методы, чтобы обработать более 1600 образцов крови уступая последовательным, высокое качество материалов, которые впоследствии были использованы в успешной метилирования ДНК, генотипирование, экспрессия генов и проточной цитометрии анализа. Некоторые из методов, используемых стандартные; Однако при сочетании описанным способом, они позволяют эффективную обработку образцов из участников общей направленности и / или от сообществаИсследования, проведенные в которые обычно не быть оценены в клинических условиях. Таким образом, этот протокол имеет потенциал, чтобы получить образцы (и впоследствии данных), которые более представительным населения в целом.
Introduction
Многочисленные исследования характеризуется различия в экспрессии генов, метилирование ДНК и клеточного подмножества в крови среди лиц с и без умственной (или другой) болезни 1-4. Эти исследования, однако, были получены из клинических условий, в которых различия связанных с заболеванием может быть увеличено за счет общем более тяжелым характером заболеваний, для которых пациенты, нуждающихся в лечении. Благодаря достижениям в области "omics" подходов, в последнее десятилетие наблюдается взрыв интереса в получении биологических образцов из сообщества и / или эпидемиологических параметров 5-7, для того, чтобы обеспечить население на основе оценки распространенности заболевания и широкую картину из экологические детерминанты этих психических и / или соматических заболеваний.
Основной проблемой в этой связи является требование для быстрой обработки собранных образцов. Деградация мононуклеарных клеток, ключевых компонентов иммунной системы, которые frequentlу используется для оценки здоровья индивида, начинается сразу же после взятия крови со значительным снижением в восстановлении после 2 часов сбора 8-10. Для решения этой проблемы, мы представляем оптимизированный протокол, в котором несколько компонентов цельной крови человека одновременно изолирован от образцов, полученных в домах субъектов, живущих в большом столичном районе. Протокол основан на нашей компиляции и модификации современных методов, в том числе хранения всех «лишних» фракций в случае будущих методы позволяют для дальнейшей изоляции / анализов. В то время как альтернативные методы или комплекты могут быть использованы вместо отдельных методов, описанных здесь, которые изложены оказались надежным и эффективным средством для обработки образцов в высокой пропускной образом. Высококачественные фракции (МНПК, ДНК, сыворотки, и РНК) свежей крови может быть произведено в течение 2 ч сбора и анализа всех готовых образцов могут быть доступны в течение 2 дней (рис 1).
Этот протокол был разработан для того, чтобы эффективно обрабатывать образцов, взятых из сообщества-жилище, взрослых жителей города Детройта для тестирования в Детройте соседства изучения здравоохранения (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), А на основе популяционных Изучение социальных и биологических детерминант посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) и других психических заболеваний. Распространенность ПТСР в Детройте более чем в два раза в среднем по стране 11,12. Определение биологических детерминант ПТСР в этой группе населения может помочь разработать соответствующие фармакологические и / или когнитивно-поведенческие вмешательства, чтобы помочь тем, кто страдает от расстройства, как в этом городское население, и в других популяциях высокого риска (например, возвращение военных ветеранов). Наша лаборатория, ранее расположенный в Wayne State University в Детройте, штат Мичиган, был выбран для обработки на основе нашего опыта в работе с образцами тканей, полученных свежие из различныхисточников, необходимость начать обработку образцов в 2 ч сбора, и наша близость к местам сбора. С этой уникальной возможностью в стороны, наша цель в том, чтобы оптимизировать обработку для наибольшей урожайности ДНК, РНК, сыворотки и мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) из каждого образца (в общей сложности N = 1639 образцов в течение 5 волн сбора образца). Процедуры, описанные здесь, могут быть выполнены одновременно в не-клинической, таким образом производя исходного материала (см таблицу 1 для средней урожайности) для множества последующих применений, включая микрочипов, эпигенетические, в режиме реального времени RT-PCR, и проточной цитометрии анализа.
Рисунок 1. Общая поток работы. В целом, процесс изображен здесь включает в себя логистику получения образцов крови от идентификации попустительство учаipants в крови обратить себя. Высокое качество, фракции (одноядерные клетки периферической крови; МНПК, ДНК, сыворотки, и РНК) свежего цельной крови может быть произведено в течение 2 ч сбора и анализа всех готовых образцов могут быть доступны в течение 2 дней. Кроме того, фракции, полученные с помощью этого метода пригодны для длительного хранения, если образцы не должны быть проверены немедленно. Вся шкала изложил здесь может быть завершена в течение одного дня (~ 5 ч) общего. Тем не менее, в такой день было бы крайне трудоемким, особенно для одного специалиста с большим опытом с методами. Таким образом, мы рекомендуем деления процедуры на 1 день по меньшей мере между двумя техниками и завершения обработки РНК в День 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описали обтекаемый протокол, который был успешно применен для обработки более 1600 образцов цельной крови в Health Study Детройт соседства. Хотя многие из этих методов имеются в существующей литературе, наш шаг за шагом компиляции, в том числе именно приуроченных изменений между каждым шаг…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Henriette Mair-Meijers for invaluable attention to detail and hours devoted to processing the blood collections. We are grateful for the graphic design expertise of Natalie Jameson Kiesling. We also appreciate the approval of the manufacturers (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)) mentioned herein to publish the use of their products as described. Funding for this work was generously provided by the National Institutes of Health award numbers DA022720, RC1MH088283, and DA022720-05-S1.
Materials
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Day 1: DNA isolation |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-1L | Day 1: PBMC isolation |
| 5 ¾” Pasteur pipets | Fisher | 13-678-6A | Day 1: PBMC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | Life Technologies | 10082147 | Day 1: PBMC isolation |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-500ml | Day 1: PBMC isolation |
| RPMI Medium 1640, liquid | Invitrogen | 11875119 | Day 1: PBMC isolation |
| 0.4% trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Cell Counting Chamber | Invitrogen | C10283 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer | Invitrogen | C10281 | Day 1: PBMC isolation |
| LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit | Ambion | 1933 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| 25G x 5/8 in. needles | Becton Dickinson | 305122 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| Syringes (5ml) | Becton Dickinson | 309646 | Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation |
| Denaturing Lysis Solution | Ambion | 8540G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 5M NaCl | Life Technologies | 24740011 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| TRI Reagent | Ambion | 9738 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| Bromo-3-chloro-propane (BCP) | Sigma | B-9673 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| spin cartridges | Ambion | 10051G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 0.1mM EDTA | Ambion | 9912 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| DNA-free Kit | Ambion | AM1960 | Day 2: DNase treament |
| RNA 6000 Ladder | Agilent | 5067-1529 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNA 6000 Nano Series II Kit | Agilent | 5067-1511 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNaseZAP | Ambion | AM8782 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| Ethanol >99% | Sigma | E7023-500ml | |
| Isopropanol >99% | Sigma | I9516-500ml | |
| Nuclease-free ultra pure water | Invitrogen | 9938 | |
| Pipette tips (nuclease-free) | Eppendorf | 22491253 | |
| Pipetter (serological) | Eppendorf | 2223020-4 | |
| Pipetters (for volumes under 1ml) | Eppendorf | 3120000-054 | |
| Pipettes (serological) | Fisher | 13-678-27E | |
| Controlled rate freezing containers | Nalgene | 5100-0001 | |
| Cryoboxes (to hold 2ml and 5ml cryovials and 1.5ml microcentrifuge tubes) | Fisher | 03-395-464 | |
| Test tube rack | Thermo Scientific | 14-804-134 | |
| 15ml polypropylene tubes | Fisher | 14-959-49D | |
| 1.5ml and 0.65 microcentrifuge tubes | Fisher | 07-200-534 and 07-200-185 | |
| 2ml and 5ml cryovials | Fisher | 10-500-26 and 10-269-88F | |
| 8ml CPT vacutainer | BD Biosciences | 362761 | 2 tubes |
| 6ml K2 EDTA vacutainer | BD Biosciences | 367863 | 2 tubes |
| 8.5ml SST vacutainer | BD Biosciences | 367988 | 1 tube |
| Vortexer | Fisher | 2215365 | |
| Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes | Fisher | 11-715-1250 | |
| Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood | Fisher | 01-257-87 | |
| Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid | Eppendorf | 22637002 | |
| Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125mm vacutainers and 15ml polypropylene tubes | Eppendorf | 22628157 | 2, one does not need to be refrigerated |
| Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device | Fisher | 13-400-411 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Liquid nitrogen tank | Thermo Scientific | 11-676-56 | |
| -80 ˚C freezer | Thermo Scientific | 992RAK | |
| Sharps container | Fisher | 22-037-970 | |
| Biological waste container | Thermo Scientific | 1223P52 | |
| Biosafety Level 2 certified cell culture hood | Thermo Scientific | 13-261-315 |
Riferimenti
- Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
- Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
- Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
- Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
- Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
- Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
- Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
- Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
- Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
- Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
- Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
- Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
- . QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010)
- Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
- Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
- Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2013).
- Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
- Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
- Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2011).
- Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2011).
- Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2010).
- Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2010).
- Bustamante, A. C., et al. . Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2013).
