التحول التنقل الكهربي الفحص (EMSA) لدراسة التفاعلات RNA-البروتين: حفيظة / IRP مثال
Summary
هنا نقدم بروتوكول لتحليل التفاعلات RNA / البروتين. ويستند هذا التحول فحص التنقل الكهربي (EMSA) على الهجرة التفاضلية المجمعات RNA / البروتين والحمض النووي الريبي مجانا خلال الأصلي الكهربائي للهلام. باستخدام مسبار RNA رديولبلد، RNA المجمعات / البروتين يمكن تصور من قبل تصوير الإشعاع الذاتي.
Abstract
التفاعلات RNA / بروتين حاسمة لمسارات التنظيمية ما بعد النسخي. بين البروتينات ملزم RNA عصاري خلوي أفضل وصف هم البروتينات التنظيمية الحديد، IRP1 وIRP2. كانت ملزمة لتسوية عناصر الاستجابة (IRES) داخل المناطق غير مترجمة (UTRs) من عدة أنواع من mRNAs الهدف، وبالتالي السيطرة على الترجمة من mRNAs أو الاستقرار. تم التفاعلات IRE / IRP درس على نطاق واسع من قبل EMSA. هنا، نحن تصف بروتوكول EMSA لتحليل النشاط IRE ملزم من IRP1 وIRP2، والتي يمكن تعميمها على تقييم نشاط البروتينات الأخرى ملزم RNA كذلك. والمحللة البروتين الخام التي تحتوي على البروتين ملزم RNA، أو إعداد النقي من هذا البروتين، وحضنت مع وجود فائض من 32 ف المسمى RNA التحقيق، والسماح لتشكيل تعقيدا. يضاف الهيبارين لمنع البروتين غير محددة للتحقيق ملزمة. وفي وقت لاحق، ويتم تحليل خليط من غير تغيير طبيعة-الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد. التحقيق الحرةيهاجر بسرعة، في حين أن RNA / البروتين المعارض معقدة التنقل المتخلفين. وبالتالي، يتم استدعاء الإجراء أيضا "التخلف هلام" أو "bandshift" الفحص. بعد الانتهاء من الكهربي، وجفت جل ويتم الكشف عنها المجمعات RNA / البروتين، وكذلك التحقيق الحرة، من خلال تصوير الإشعاع الذاتي. ويتمثل الهدف العام من البروتوكول هو لكشف وتحديد IRE / IRP وغيرها من التفاعلات RNA / البروتين. وعلاوة على ذلك، EMSA يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد النوعية وتقارب ملزم، ورياضيات الكيمياء للتفاعل RNA / البروتين قيد التحقيق.
Introduction
وقد تم تطوير EMSA في الأصل لدراسة العلاقة من البروتينات الحمض النووي ملزم مع تسلسل الحمض النووي الهدف 1،2. والمبدأ هو مماثل لتفاعلات RNA / البروتين 3، الذي هو محور من هذه المادة. لفترة وجيزة، واتهم RNA سلبا وسوف يهاجر نحو القطب الموجب خلال عدم تغيير طبيعة-الكهربائي في بولي أكريلاميد (أو الاغاروز) المواد الهلامية. الهجرة داخل هلام تعتمد على حجم الحمض النووي الريبي، والذي يتناسب مع شحنتها. ملزمة محددة من البروتين لRNA يغير التنقل بها، ويهاجر المعقدة أبطأ بالمقارنة مع RNA مجانا. ويرجع ذلك أساسا إلى زيادة في الكتلة الجزيئية، ولكن أيضا إلى تغييرات في تهمة وربما التشكل هذا. الاستفادة من RNA وصفت بأنها التحقيق يتيح رصد سهل من "التخلف هلام" أو "bandshift". استخدام 32 تحقيقات RNA المسمى P شائع جدا ويوفر حساسية عالية. تم الكشف عن هجرة RNA / مجمعات البروتين والحمض النووي الريبي مجاناعن طريق تصوير الإشعاع الذاتي. السلبيات هي قصيرة العمر النصفي لل32 P (14.29 يوما)، وتدهور تدريجي في نوعية التحقيق بسبب الإنحلال الإشعاعي، واشتراط وجود رخصة النشاط الإشعاعي والبنية التحتية للعمل الإشعاعي، والمخاوف المحتملة للسلامة الأحيائية. لذلك، تم تطوير أساليب غير النظائر بديلة لوصفها التحقيق RNA، على سبيل المثال مع fluorophores أو البيوتين، والتي تتيح الكشف عن طريق الفلورسنت أو chemiluminescent التصوير 4،5. القيود المفروضة على هذه الأساليب هي تكلفة أعلى، وغالبا ما خفض حساسية مقارنة مع وضع العلامات النظائر، واحتمال من التسميات غير النظائر للتدخل في التفاعل RNA / البروتين. غير تغيير طبيعة المواد الهلامية بولي أكريلاميد هي مناسبة لمعظم التطبيقات EMSA وتستخدم بشكل شائع. في بعض الأحيان، قد المواد الهلامية الاغاروز تشكل بديلا لتحليل المجمعات الكبيرة.
والميزة الرئيسية لEMSA هو أنه يجمع بين البساطة، والحساسية، ومتانة 4 </ سوب>. الفحص يمكن أن تكتمل في غضون ساعات قليلة و لا يتطلب أجهزة متطورة. يمكن الكشف عن التفاعلات RNA / البروتين EMSA في تركيزات منخفضة تصل إلى 0.1 نانومتر أو أقل، وضمن مجموعة واسعة من الشروط الملزمة (درجة الحموضة 4،0-9،5، أحادي التكافؤ تركيز الملح 1-300 ملم، ودرجة حرارة 0-60 درجة مئوية).
ويمكن أيضا RNA / البروتين تشكيل معقد دراستها من قبل مقايسة ملزمة التصفية. هذا هو إجراء بسيط، سريع، وغير مكلفة على أساس الإبقاء على المجمعات RNA / البروتين في مرشح النيتروسليلوز، في حين يمر التحقيق RNA مجانا إلى 6. مقارنة EMSA، هي محدودة في الحالات التي يحتوي التحقيق RNA مواقع ملزمة متعددة، أو استخراج النفط الخام يحتوي على أكثر من البروتينات ملزم RNA التي تربط إلى التحقيق في نفس الموقع. في حين متعددة التفاعلات RNA / البروتين سوف يعدم قبل الفحص ملزمة التصفية، يمكن تصور بسهولة عن طريق EMSA. في بعض الحالات، والتصور هو عشيةن ممكن عندما مجمعين RNA / البروتين شارك في ترحيل (على سبيل المثال، IRP1 البشرية / IRE وIRP2 / المجمعات غضب)، وذلك بإضافة الأجسام المضادة ضد واحد من البروتينات ملزم RNA إلى رد فعل EMSA، مما أسفر عن مزيد من التخلف على هلام ( "supershift") 7.
وقد تم EMSA تستخدم على نطاق واسع لدراسة IRP1 وIRP2، والتي هي المنظمين ما بعد النسخي من استقلاب الحديد 8-10. وهي تعمل عن طريق ملزمة لIRES، والهياكل دبوس الحفاظ phylogenetically داخل UTRs العديد من mRNAs 11. تم اكتشاف IRES لأول مرة في من mRNAs ترميز الفيريتين 12 و ترانسفيرين مستقبلات 1 (TfR1) 13، والبروتينات من تخزين الحديد وامتصاص، على التوالي. في وقت لاحق، تم العثور على IRES في محمر محددة أمينوليفولينات سينسيز (ALAS2) 14، أكونيتاز الميتوكوندريا 15، ferroportin 16، نقل معدن ثنائي التكافؤ 1 (DMT1) 17، نقص الأكسجة عامل محرض 2 <eم> α (HIF2α) 18، وغيرها من mRNAs 19-21. وH- النموذج و-L فيريتين من mRNAs احتواء غضب واحدة في حياتهم 5 'UTR، في حين TfR1 مرنا يحتوي IRES متعددة في تقريرها 3' UTR. التفاعلات IRE / IRP تمنع تحديدا الفيريتين الترجمة مرنا من خلال منع sterically ارتباطه من 43S الوحيدات الريباسي. وعلاوة على ذلك، فإنها استقرار TfR1 مرنا ضد الانقسام endonucleolytic. IRP1 وحصة IRP2 تسلسل واسعة التشابه وعرض عالية النشاط ملزم غضب في الخلايا المتعطشة الحديد. في الخلايا من الحديد حافل، IRP1 يجمع على cubane الحديد-S العنقودية التي تحولها إلى أكونيتاز عصاري خلوي على حساب النشاط IRE ملزم، في حين IRP2 يخضع لتدهور proteasomal. وهكذا، فإن التفاعلات IRE / IRP تعتمد على حالة الحديد الخلوي، ولكن يتم تنظيمها أيضا إشارات أخرى، مثل H 2 O 2، وأكسيد النيتريك (NO) أو نقص الأكسجة. هنا، نحن تصف بروتوكول لتقييم النشاط IRE ملزم من خلية النفط الخام والأنسجة مقتطفات عن طريق البريدMSA. استخدمنا 32 ف المسمى التحقيق غضب H-فيريتين التي تم إنشاؤها بواسطة النسخ في المختبر من قالب DNA البلازميد (I-12.CAT)، حيث تم إدخال تسلسل غضب في الأصل بمعنى التوجه المصب لموقع البلمرة T7 RNA من قبل استنساخ [أليغنوكليوتيد الاصطناعية صلب 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف البروتوكول الذي تم تطويره لدراسة الأنشطة غضب ملزم من IRP1 وIRP2، ونحن نبين بيانات تمثيلية. باستخدام مجسات مختلفة، يمكن هذا البروتوكول أيضا أن تعدل لدراسة أخرى البروتينات ملزم RNA. والخطوة الحاسمة هي حجم التحقيق. استخدام تحقيقات طويلة، وهو أمر شائع عند موقع مل…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
Riferimenti
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
- Rio, D. C. . Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).
- Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5′ untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
- Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
- Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
- Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
- Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
- Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
- Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
- Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
- McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
- Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
- Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
- Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3′-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
- Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
- Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
- Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
- Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
- Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
- Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
- Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
- Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
- Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
- Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
- Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).
