गुस्सा / IRP उदाहरण: आरएनए प्रोटीन बातचीत के अध्ययन के लिए electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट परख (EMSA)
Summary
यहाँ हम आरएनए / प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA) देशी जेल वैद्युतकणसंचलन दौरान शाही सेना / प्रोटीन परिसरों और मुफ्त शाही सेना के अंतर प्रवास पर आधारित है। एक radiolabeled शाही सेना जांच का उपयोग करके, आरएनए / प्रोटीन परिसरों autoradiography द्वारा देखे जा सकते हैं।
Abstract
आरएनए / प्रोटीन बातचीत के बाद विनियामक रास्ते के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे अच्छा विशेषता साइटोसोलिक आरएनए बंधनकारी प्रोटीन के अलावा लोहे विनियामक प्रोटीन, IRP1 और IRP2 हैं। वे इस तरह mRNAs अनुवाद या स्थिरता को नियंत्रित करने, कई लक्ष्य mRNAs का ग़ैर-अनुवादित क्षेत्रों (UTRs) के भीतर उत्तरदायी तत्वों (IRES) लोहे करने के लिए बाध्य। गुस्सा / IRP बातचीत का व्यापक रूप से EMSA द्वारा अध्ययन किया गया है। यहाँ, हम के रूप में अच्छी तरह से अन्य शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन की गतिविधि का आकलन करने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है जो IRP1 और IRP2 का गुस्सा बाध्यकारी गतिविधि, विश्लेषण करने के लिए EMSA प्रोटोकॉल का वर्णन है। एक शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन, या इस प्रोटीन का एक शुद्ध तैयारी युक्त एक कच्चे प्रोटीन lysate, जटिल गठन के लिए अनुमति देने के लिए, 32 पी लेबल शाही सेना जांच की एक अतिरिक्त के साथ incubated है। हेपरिन बंधन की जांच के लिए गैर विशिष्ट प्रोटीन रोकना करने के लिए जोड़ा गया है। इसके बाद, मिश्रण एक polyacrylamide जेल पर गैर denaturing वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया है। नि: शुल्क जांच, तेजी से migrates जबकि शाही सेना / प्रोटीन जटिल दर्शाती मंद गतिशीलता; इसलिए, प्रक्रिया भी "जेल मंदता" या "bandshift" परख कहा जाता है। वैद्युतकणसंचलन के पूरा होने के बाद, जेल सूख रहा है और शाही सेना / प्रोटीन परिसरों, साथ ही नि: शुल्क जांच, autoradiography से पता चला रहे हैं। प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य का पता लगाने और गुस्सा / IRP और अन्य आरएनए / प्रोटीन बातचीत यों की है। इसके अलावा, EMSA भी जांच के तहत शाही सेना / प्रोटीन बातचीत की विशिष्टता, बंधन आत्मीयता, और stoichiometry निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
EMSA मूल लक्ष्य डीएनए दृश्यों 1,2 के साथ डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन की एसोसिएशन अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। सिद्धांत इस लेख का ध्यान केंद्रित है, जो शाही सेना / प्रोटीन बातचीत 3, के लिए समान है। संक्षेप में, आरएनए नकारात्मक आरोप लगाया है और polyacrylamide (या agarose) जैल में गैर denaturing वैद्युतकणसंचलन दौरान एनोड की ओर पलायन होगा। जेल के भीतर प्रवासन अपने आरोप के लिए आनुपातिक है जो शाही सेना, के आकार पर निर्भर करता है। विशिष्ट शाही सेना के लिए एक प्रोटीन के बंधन मुक्त शाही सेना की तुलना में जटिल migrates धीमी अपनी गतिशीलता को बदल देता है, और। इस आणविक जन में वृद्धि करने के लिए, लेकिन यह भी आरोप है और संभवतः रचना में परिवर्तन की वजह से है। जांच के रूप में एक लेबल शाही सेना का उपयोग "जेल मंदता" या "bandshift" की आसान निगरानी की अनुमति देता है। 32 पी लेबल शाही सेना जांच के उपयोग बहुत आम है और उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है। आरएनए / प्रोटीन परिसरों और मुफ्त शाही सेना के प्रवास पता चला रहे हैंautoradiography द्वारा। कमियां 32 पी (14.29 दिन) होने के कारण radiolysis करने के लिए जांच की गुणवत्ता का क्रमिक गिरावट से कम आधा जीवन कर रहे हैं, एक रेडियोधर्मिता लाइसेंस और रेडियोधर्मिता के काम के लिए बुनियादी सुविधाओं, और संभावित जैव सुरक्षा चिंताओं की आवश्यकता। इसलिए, शाही सेना जांच लेबलिंग के लिए वैकल्पिक गैर समस्थानिक विधियों फ्लोरोसेंट या chemiluminescent इमेजिंग 4,5 द्वारा पता लगाने के लिए सक्षम है, जो fluorophores या बायोटिन, साथ उदाहरण के लिए विकसित किया गया है। इन तरीकों की सीमाओं उच्च लागत और समस्थानिक लेबलिंग की तुलना में अक्सर कम संवेदनशीलता, और आरएनए / प्रोटीन बातचीत के साथ हस्तक्षेप करने के लिए गैर-समस्थानिक लेबल की क्षमता है। गैर denaturing polyacrylamide जैल सबसे EMSA अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं और आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है। इस अवसर पर, agarose जैल बड़े परिसरों के विश्लेषण के लिए एक वैकल्पिक खड़ी हो सकती है।
EMSA के प्रमुख लाभ यह सादगी, संवेदनशीलता, और मजबूती 4 जोड़ती है </ Sup>। परख के कुछ ही घंटों के भीतर पूरा किया जा सकता है और परिष्कृत इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता नहीं है। आरएनए / प्रोटीन बातचीत 0.1 एनएम या उससे कम के रूप में के रूप में कम मात्रा में EMSA से पता लगाया जा सकता है और एक व्यापक बाध्यकारी शर्तों की सीमा के भीतर (पीएच 4.0-9.5, monovalent नमक एकाग्रता 1-300 मिमी, और तापमान 0-60 डिग्री सेल्सियस)।
आरएनए / प्रोटीन जटिल गठन भी फिल्टर बाध्यकारी परख द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। एक नि: शुल्क शाही सेना जांच 6 से होकर गुजरता है, जबकि यह एक nitrocellulose फिल्टर में शाही सेना / प्रोटीन परिसरों की अवधारण के आधार पर एक सरल, तेज, और कम खर्चीली प्रक्रिया है। EMSA की तुलना में, यह शाही सेना जांच के बंधन, कई साइटों में शामिल है, या कच्चे तेल निकालने में एक ही स्थल पर जांच करने के लिए बाध्य है कि एक से अधिक शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन होता है, जहां मामलों में सीमित है। कई आरएनए / प्रोटीन बातचीत फिल्टर बाध्यकारी परख द्वारा पता लगाने से बच जाएगा, वहीं वे आसानी से EMSA द्वारा देखे जा सकते हैं। कुछ मामलों में, दृश्य पूर्व संध्या हैएन संभव है, जब जेल पर आगे मंदता उपज EMSA प्रतिक्रिया के लिए शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन से एक के खिलाफ एक एंटीबॉडी जोड़कर सह पलायन (उदाहरण के लिए, मानव IRP1 / गुस्सा और IRP2 / गुस्सा परिसरों) दो आरएनए / प्रोटीन परिसरों ( "supershift") 7।
EMSA व्यापक रूप से लोहे के चयापचय में 8-10 के बाद के ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों हैं जो IRP1 और IRP2, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। वे कई mRNAs 11 UTRs भीतर IRES, जातीवृति के आधार पर संरक्षित बाल के लिये कांटा संरचनाओं के बंधन से कार्य करते हैं। IRES पहले ferritin 12 और transferrin रिसेप्टर 1 (TfR1) 13, क्रमशः लोहे भंडारण और तेज, का प्रोटीन एन्कोडिंग mRNAs में खोज रहे थे। बाद में, IRES एर्य्थ्रोइद-विशिष्ट aminolevulinate सिन्थेज़ (ALAS2) 14, माइटोकॉन्ड्रियल aconitase 15, ferroportin 16, द्विसंयोजक धातु ट्रांसपोर्टर 1 (DMT1) 17, हाइपोक्सिया inducible कारक 2 में पाए गए <eएम> α (HIF2α) 18, और अन्य mRNAs 19-21। UTR 'TfR1 mRNA के अपने तीन में कई IRES होता है, जबकि, UTR' प्रोटोटाइप एच और एल ferritin mRNAs उनके 5 में एक गुस्सा होते हैं। गुस्सा / IRP बातचीत विशेष रूप से sterically 43s ribosomal सबयूनिट के अपने सहयोग को अवरुद्ध करके ferritin mRNA के अनुवाद रोकना; इसके अलावा, वे endonucleolytic दरार के खिलाफ TfR1 mRNA के स्थिर। IRP1 और IRP2 शेयर व्यापक अनुक्रम समानता और लोहे की कमी से जूझ कोशिकाओं में उच्च गुस्सा बाध्यकारी गतिविधि दिखा रहे हैं। IRP2 proteasomal गिरावट undergoes जबकि लौह-भरा पड़ा कोशिकाओं में, IRP1 अपने क्रोध बाध्यकारी गतिविधि की कीमत पर साइटोसोलिक aconitase में धर्मान्तरित कि एक cubane फ़े-एस क्लस्टर assembles। इस प्रकार, गुस्सा / IRP बातचीत सेलुलर लोहे की स्थिति पर निर्भर करता है, लेकिन यह भी इस तरह के एच 2 ओ 2, नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) या हाइपोक्सिया के रूप में अन्य संकेतों द्वारा विनियमित रहे हैं। यहाँ, हम ई द्वारा कच्चे तेल की सेल और ऊतक के अर्क से गुस्सा बाध्यकारी गतिविधि का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णनएमएसए। हम गुस्सा अनुक्रम मूल रूप से नीचे की ओर T7 शाही सेना पोलीमरेज़ साइट की भावना अभिविन्यास में पेश किया गया था जहां एक प्लास्मिड डीएनए टेम्पलेट (I-12.CAT), से इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा उत्पन्न की गई थी कि एक 32 पी लेबल एच ferritin गुस्सा जांच इस्तेमाल किया annealed सिंथेटिक oligonucleotides के 22 की क्लोनिंग।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ, हम IRP1 और IRP2 का गुस्सा बाध्यकारी गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और हम प्रतिनिधि डेटा दिखाने के लिए। विभिन्न जांच का उपयोग करके, इस प्रोटोकॉल ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
Riferimenti
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