IRE / IRP例：RNA - タンパク質相互作用の研究のための電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）
Summary
ここでは、RNA /タンパク質相互作用を分析するためのプロトコルを提示する。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、ネイティブゲル電気泳動中のRNA /タンパク質複合体および遊離RNAの差動移動に基づいている。放射性標識RNAプローブを用いて、RNA /タンパク質複合体は、オートラジオグラフィーによって可視化することができる。
Abstract
RNA /タンパク質相互作用は、転写後の調節経路に重要である。最もよく特徴付け細胞質ゾルRNA結合タンパク質のうち鉄調節タンパク質 、IRP1及びIRP2がある。彼らは、それによってmRNAの翻訳や安定性を制御する、いくつかの標的mRNAの翻訳領域（UTR）内の応答要素（IRES）を鉄に結合する。 IRE / IRP相互作用は広くEMSAによって研究されている。ここでは、他のRNA結合タンパク質の活性を評価するために一般化することができるIRP1及びIRP2のIRE結合活性を分析するためのEMSAプロトコルを記述する。 RNA結合タンパク質、またはこのタンパク質の精製調製物を含む粗タンパク質溶解物を、複合体形成を可能にする、32 P標識したRNAプローブの過剰と共にインキュベートする。ヘパリン結合プローブする非特異的タンパク質を排除するために添加される。その後、混合物をポリアクリルアミドゲル上で非変性電気泳動によって分析される。遊離プローブRNA /タンパク質複合体の展示遅滞モビリティながら、高速で移動し、。したがって、手順は、「ゲル遅延」または「バンドシフト」アッセイと呼ばれている。電気泳動終了後、ゲルを乾燥させ、RNA /タンパク質複合体、ならびに遊離プローブは、オートラジオグラフィーによって検出される。プロトコルの全体的な目標は、IRE / IRP及び他のRNA /タンパク質相互作用を検出および定量化することである。また、EMSAも調査中のRNA /タンパク質相互作用の特異性は、結合親和性、および化学量論を決定するために用いることができる。
Introduction
EMSAは、もともとの標的DNA配列1,2-有するDNA結合タンパク質の結合を研究するために開発された。原理は、この記事の焦点であるRNA /タンパク質相互作用3、についても同様である。簡単に言えば、RNAが負に帯電され、ポリアクリルアミド（またはアガロース）ゲル中で非変性電気泳動中に陽極に向かって移動します。ゲル内の移行は、その電荷に比例する、RNAのサイズに依存します。 RNAへのタンパク質の特異的結合は、その機動性を変化させ、そして複合体は、無料のRNAに比べてゆっくりと移動。これは主に、分子量の増加だけでなく、電荷およびおそらく立体配座の変化によるものである。プローブとして標識されたRNAを利用する「ゲル遅延」や「バンドシフト」の容易な監視を可能にする。 32 P標識RNAプローブの使い方は非常に一般的であり、高感度を提供しています。 RNA /タンパク質複合体および遊離RNAの移行が検出されるオートラジオグラフィーによる。欠点は、放射能の仕事、および潜在的なバイオセーフティの懸念のための放射能のライセンスとインフラの要件、32 P（14.29日）の半減期が短いことによる放射線分解へのプローブの品質の漸進的な劣化である。したがって、RNAプローブを標識するための代替の非同位体の方法は、蛍光または化学発光イメージング4,5による検出を可能にする蛍光団又はビオチン、とのインスタンスのために、開発されてきた。これらの方法の限界は、同位体標識、およびRNA /タンパク質相互作用を妨害するための非同位体標識の可能性と比較してより高いコストと多くの場合減少した感受性である。非変性ポリアクリルアミドゲルは、ほとんどのEMSAの用途に適していると一般的に使用される。機会に、アガロースゲルは、大きな複合体の分析のための代替手段をもたらすことができる。
EMSAの主な利点は、シンプルさ、感度、および堅牢性4を組み合わせたということです</ SUP>。アッセイは、数時間以内に完了することができ、洗練された機器を必要としません。 RNA /タンパク質相互作用は、0.1 nMもしくはそれ未満という低い濃度でEMSAによって検出され、結合条件（pHは4.0から9.5、一価の塩濃度が1から300 mMの、温度0から60°C）の広い範囲にすることができる。
RNA /タンパク質複合体の形成はまた、フィルター結合アッセイによって研究することができる。フリーRNAプローブ6を通過する間に、これは、ニトロセルロースフィルターでRNA /タンパク質複合体の保持に基づいて、簡単、迅速、かつ安価な手順である。 EMSAと比較して、そのRNAプローブは複数の結合部位が含まれているか、または粗抽出物は、同じ部位でプローブと結合する二つ以上のRNA結合タンパク質を含む場合には制限されている。複数のRNA /タンパク質相互作用は、フィルター結合アッセイによる検出を免れるであろうが、それらは容易にEMSAによって可視化することができる。いくつかのケースでは、可視化は前夜ですn個の可能な場合、ゲル上でさらに位相差を生じ、EMSA反応のRNA結合タンパク質のいずれかに対する抗体を添加することによって共移行（例えば、ヒトIRP1 / IRE及びIRP2 / IRE複合体）は、2つのRNA /タンパク質複合体（ 「スーパーシフト」）7。
EMSAは、広く鉄代謝8-10の転写後調節因子である、IRP1及びIRP2を研究するために使用されてきた。彼らはいくつかのmRNA 11のUTRを内のIRE、系統発生的に保存されたヘアピン構造に結合することによって作動する。 IREは、最初フェリチン12及びトランスフェリン受容体1（TfR1）13、それぞれ鉄貯蔵および取り込み、タンパク質をコードするmRNAで発見された。その後、IRESは赤血球固有のアミノレブリン酸シンターゼ （ALAS2）14、ミトコンドリアのアコニターゼ15、フェロポーチン16、 二価金属トランスポーター1（DMT1）17、低酸素誘導因子2で発見された<eM>α（HIF2α）18、および他のmRNA 19-21。 UTR「TfR1のmRNAはその3で複数のIREが含まれていますが、UTR「プロトタイプH-およびL-フェリチンmRNAは、それらの5で1 IREが含まれている。 IRE / IRPの相互作用は、具体的には、立体的に43Sリボソームサブユニットの関連付けをブロックすることによりフェリチンmRNAの翻訳を阻害。また、それらは、エンドヌクレアーゼ的切断に対してTfR1 mRNAを安定化する。 IRP1及びIRP2を共有広範な配列類似性と鉄飢餓細胞で高IRE-結合活性を示す。 IRP2がプロテアソーム分解を受けながら鉄充実した細胞では、IRP1は、そのIRE結合活性を犠牲にして細胞質ゾルアコニターゼに変換キュバンのFe-Sクラスターを組み立てる。従って、IRE / IRP相互作用は、細胞の鉄の状態に依存するだけでなく、そのようなH 2 O 2、一酸化窒素（NO）または低酸素症のような他の信号によって調節される。ここでは、Eによって粗細胞および組織抽出物からIRE結合活性を評価するためのプロトコルを記述しMSA。我々は、IRE配列が元々下流T7 RNAポリメラーゼ部位のセンス方向に導入されたプラスミドのDNAテンプレート（I-12.CAT）からのインビトロ転写によって生成した32 P標識H-フェリチンIREプローブを使用アニーリングした合成オリゴヌクレオチド22のクローニング。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで、我々はIRP1及びIRP2のIRE-結合活性を研究するために開発されたプロトコルを記述し、我々は代表的なデータを示している。異なるプローブを使用することによって、このプロトコルは、他のRNA結合タンパク質の研究のために調整することができる。重要なステップは、プローブのサイズです。正確な結合部位が不明な場合に共通している長いプローブの使用方法は、無料のRNAとは異な?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
Riferimenti
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