Электрофоретической подвижности сдвига анализа (EMSA) по изучению РНК-белковых взаимодействий: ИРЭ / IRP примера
Summary
Здесь мы приводим протокол для анализа РНК / белковые взаимодействия. Сдвиг анализа электрофоретической подвижности (EMSA) основан на дифференциальной миграции РНК / белковые комплексы и свободной РНК в процессе электрофореза нативного гель. При использовании радиоактивно помеченных РНК-зонда, РНК / белковые комплексы могут быть визуализированы с помощью авторадиографии.
Abstract
РНК / белковые взаимодействия являются критическими для посттранскрипционных регуляторных путей. Среди наиболее изученных цитозольными РНК-связывающих белков железные регуляторные белки, IRP1 и IRP2. Они связывают гладить реактивные элементы (IRES) в нетранслируемых регионов (НТО) нескольких целевых мРНК, тем самым управляя перевод или стабильность мРНК. IRE / ПИВТ взаимодействия были широко изучены EMSA. Здесь мы опишем протокол EMSA для анализа ИРЭ-связывающую активность в IRP1 и IRP2, которые могут быть обобщены для оценки активности других РНК-связывающих белков, а также. Неочищенный лизат белков, содержащих РНК-связывающий белок, или очищенный препарат этого белка, инкубируют с избытком 32 P-меченного зонда РНК, что позволило для образования комплекса. Гепарин добавляется исключает неспецифическое белок, чтобы исследовать связывание. Затем смесь анализируют без денатурации электрофорезом на полиакриламидном геле. Бесплатно зондмигрирует быстро, в то время как РНК / белковый комплекс экспонатов отсталых мобильности; Таким образом, процедура также называется "гель задержка" или "bandshift" анализа. После завершения электрофореза гель сушат и РНК / белковые комплексы, а также свободный зонда, обнаруживаются с помощью авторадиографии. Общая цель протокола заключается в выявлении и количественной IRE / IRP и другие РНК / белковые взаимодействия. Кроме того, EMSA также может быть использован для определения специфичности, аффинности связывания и стехиометрию взаимодействия РНК / белок изучаемого.
Introduction
EMSA был первоначально разработан для изучения связи ДНК-связывающих белков с последовательностями ДНК-мишени 1,2. Принцип одинаков для РНК / белковые взаимодействия 3, которая является предметом данной статьи. Вкратце, РНК отрицательно заряженные и будет мигрировать к аноду при не-денатурирующих электрофореза в полиакриламидном (или агарозных гелей). Миграция в геле зависит от размера РНК, которая пропорциональна его заряда. Специфическое связывание белка с РНК изменяет свою подвижность, и комплекс мигрирует медленнее по сравнению со свободной РНК. Это, главным образом, за счет увеличения молекулярной массы, но также к изменениям в ведении и, возможно, конформации. Используя меченой РНК в качестве зонда позволяет легко мониторинг "задержки в геле" или "bandshift". Использование 32 P-меченой РНК зондов является очень распространенным явлением и обладает высокой чувствительностью. Миграция РНК / белковые комплексы и свободной РНК обнаруженыавторадиографией. Недостатки являются короткий период полувыведения из 32 P (14,29 дней), постепенное ухудшение качества зонда из-за радиолиза, требование лицензии радиоактивности и инфраструктуры на предмет радиоактивности работы, и потенциальных проблем биобезопасности. Таким образом, альтернативные-изотопные методы мечения РНК-зонда были разработаны, например, с флуорофорами или биотин, которые позволяют обнаружение флуоресцентной или хемилюминесцентной изображений 4,5. Ограничения этих методов более высокую стоимость и часто пониженная чувствительность по сравнению с изотопной метки, и потенциал неизотопных этикеток вмешиваться взаимодействия РНК / белок. Неденатурирующем гели полиакриламида подходят для большинства применений EMSA и обычно используются. В отдельных случаях, гели агарозы могут представлять собой альтернативу для анализа больших комплексов.
Основным преимуществом EMSA является то, что он сочетает в себе простоту, чувствительность и надежность 4 </ SUP>. Анализ может быть завершена в течение нескольких часов и не требует сложного инструментария. РНК / белковые взаимодействия могут быть обнаружены с помощью EMSA в таких низких концентрациях, как 0,1 нМ или менее, и в широком диапазоне условий связывания (рН 4,0 – 9,5, концентрация соли одновалентного 1 – 300 мм, а температура 0 – 60 ° С).
РНК / белок образование комплекса также может быть изучена с фильтром анализа связывания. Это просто, быстро и недорого процедура, основанная на сохранении РНК / белковых комплексов в нитроцеллюлозный фильтр, в то время как свободной РНК зонд проходит через 6. По сравнению с EMSA, оно ограничено в случаях, когда РНК-зонда содержит несколько сайтов связывания, или неочищенный экстракт содержит более одного РНК-связывающие белки, которые связываются с зондом в том же месте. В то время как несколько РНК / белковые взаимодействия будет избежать обнаружения фильтра-анализе связывания, они могут быть легко визуализированы с помощью EMSA. В некоторых случаях, визуализация наканунеп возможно, когда два РНК / белковые комплексы со мигрируют (например, человек IRP1 / IRE и IRP2 / IRE комплексы), добавляя антитела против одного из РНК-связывающих белков в реакции EMSA, уступая дальнейшее замедление на геле ( "supershift") 7.
EMSA широко используется для изучения IRP1 и IRP2, которые являются пост-транскрипционные регуляторы метаболизма железа 8-10. Они работают путем связывания с ИРЭС филогенетически консервативных шпилька структур в UTRs нескольких мРНК 11. Ires были впервые обнаружены в мРНК, кодирующих ферритина 12 и рецептора трансферрина 1 (TfR1) 13, белки хранения железа и поглощения, соответственно. Позже, Ires были найдены в эритроидных конкретных аминолевулинат синтазы (ALAS2) 14, митохондриальная аконитазы 15, Ferroportin 16, двухвалентный металл транспортера 1 (DMT1) 17, индуцируемого гипоксией фактора 2 <eм> α (HIF2α) 18, и других генов 19-21. Н прототип и L-ферритина мРНК содержат один IRE в их 5 'UTR, а TfR1 мРНК содержит несколько Ires в своей 3' UTR. IRE / ПИВТ взаимодействия специфически ингибируют ферритина перевод мРНК пространственно блокируя его ассоциацию 43S субъединицы рибосомы; Кроме того, они стабилизируют TfR1 мРНК против эндонуклеолитическим расщепления. IRP1 и IRP2 доля сходство обширная последовательности и обладают высокой ИРЭ-связывающей активности железосодержащих голодали клеток. В железо-изобилует клеток, IRP1 собирает кубан Fe-S кластер, который преобразует его в цитозоле аконитазы за счет его ИРЭ-связывающей активности, в то время как IRP2 деградирует протеасомной. Таким образом, IRE / ПИВТ взаимодействия зависит от состояния клеточного железа, но также регулируются другими сигналами, такими как H 2 O 2, окись азота (NO) или гипоксии. Здесь мы опишем протокол для оценки ИРЭ-связывающей активности от неочищенных клеточных и тканевых экстрактов EMSA. Мы использовали 32 P-меченого Н-ферритина IRE зонд, который был создан путем транскрипции в пробирке из шаблона плазмидной ДНК (I-12.CAT), где последовательность ИРЭ был первоначально введенного в смысле ориентации ниже по потоку от полимеразы Т7 РНК-сайта путем Клонирование отожженных синтетических олигонуклеотидов 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем протокол, который был разработан для изучения IRE-связывающих деятельности IRP1 и IRP2, и мы показываем репрезентативные данные. С помощью различных зондов, этот протокол также может быть скорректирована для изучения других РНК-связывающих белков. Важным шагом является разм…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
Riferimenti
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
- Rio, D. C. . Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).
- Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5′ untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
- Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
- Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
- Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
- Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
- Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
- Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
- Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
- McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
- Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
- Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
- Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3′-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
- Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
- Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
- Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
- Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
- Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
- Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
- Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
- Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
- Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
- Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
- Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).
