Elektrofore Mobility Shift Assay (EMSA) för studier av RNA-proteininteraktioner: The IRE / IRP Exempel
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att analysera RNA / proteininteraktioner. Den elektroforetiska rörligheten shift assay (EMSA) är baserad på den differentiella migreringen av RNA / proteinkomplex och fri RNA under nativ gelelektrofores. Genom att använda en radiomärkt RNA-prob, kan RNA / proteinkomplex visualiseras genom autoradiografi.
Abstract
RNA / proteinväxelverkningar är kritiska för post-transkriptionella regulatoriska vägar. Bland de bäst karakteriserade cytosoliska RNA-bindande proteiner är järn reglerande proteiner, IRP1 och IRP2. De binder till järn responsiva element (IRES) inom de oöversatta regionerna (UTR) för flera målgrupper mRNA, därigenom styra mRNA översättning eller stabilitet. IRE / IRP interaktioner har studerats ingående av EMSA. Här beskriver vi EMSA protokoll för att analysera IRE-bindande aktivitet IRP1 och IRP2, vilket kan generaliseras för att bedöma aktiviteten hos andra RNA-bindande proteiner också. Ett råprotein lysat innehållande ett RNA-bindande protein, eller en renad beredning av detta protein, inkuberas med ett överskott av 32 P-märkt RNA-sond, vilket möjliggör komplexbildning. Heparin tillsätts för att utesluta icke-specifikt protein för att sondera bindning. Därefter blandningen analyserades genom icke-denaturerande elektrofores på en polyakrylamidgel. Den fri probvandrar snabbt, medan RNA / protein komplex utställningar efterbliven rörlighet; följaktligen är förfarandet även kallad "gelretardation" eller "bandshift" -analys. Efter fullbordande av elektrofores gelén torkas och RNA / proteinkomplex, liksom fri prob, detekteras genom autoradiografi. Det övergripande målet med protokollet är att detektera och kvantifiera IRE / IRP och andra RNA / proteininteraktioner. Dessutom kan EMSA också användas för att bestämma specificiteten, bindningsaffinitet och stökiometrin av RNA / proteininteraktioner under utredning.
Introduction
Den EMSA utvecklades ursprungligen för att studera sammanslutning av DNA-bindande proteiner med mål-DNA-sekvenser 1,2. Principen är densamma för RNA / proteininteraktioner 3, vilket är i fokus för denna artikel. I korthet RNA negativt laddad och kommer att migrera mot anoden under icke-denaturerande elektrofores i polyakrylamid (eller agaros) geler. Migration i gelén beror på storleken av RNA, som är proportionell mot dess laddning. Specifik bindning av ett protein till RNA förändrar sin rörlighet och de komplexa migrerar långsammare jämfört med den fria RNA. Detta beror främst på en ökning i molekylvikt, men också till förändringar i laddningen och eventuellt konformation. Använda en märkt RNA som sond möjliggör enkel övervakning av "gelretardation" eller "bandshift". Användning av 32 P-märkta RNA-sonder är mycket vanligt och erbjuder hög känslighet. Migreringen av RNA / proteinkomplex och gratis RNA upptäcksgenom autoradiografi. Nackdelar är den korta halveringstiden för 32 P (14,29 dagar), den gradvisa försämringen av kvaliteten på sonden pga strålning, kravet på en radioaktivitet licens och infrastruktur för radioaktivitet arbete, och potentiella biosäkerhet oro. Därför har alternativa icke-isotop metoder för märkning av RNA-sond utvecklats, till exempel med fluoroforer eller biotin, vilket möjliggör detektion av fluorescerande eller kemiluminescerande avbildning 4,5. Begränsningar av dessa metoder är den högre kostnaden och ofta minskad känslighet jämfört med isotopmärkning, och potentialen för icke-isotop etiketter för att störa interaktionen RNA / protein. Icke-denaturerande polyakrylamidgeler är lämplig för de flesta EMSA tillämpningar och används ofta. Ibland kan agarosgeler utgöra ett alternativ för analys av stora komplex.
Den stora fördelen med EMSA är att den kombinerar enkelhet, känslighet och robusthet 4 </ Sup>. Analysen kan slutföras inom ett par timmar och inte kräver sofistikerad instrumentering. RNA / protein-interaktioner kan detekteras genom EMSA vid koncentrationer så låga som 0,1 nM eller mindre, och inom ett brett spektrum av bindningsbetingelser (pH 4,0-9,5, envärda saltkoncentration 1-300 mM, och temperatur 0-60 ° C).
RNA / proteinkomplexbildning kan också studeras genom filterbindningsanalysen. Detta är en enkel, snabb och billig procedur baserad på lagring av RNA / proteinkomplex i en nitrocellulosa filter, medan en fri RNA prob passerar 6. Jämfört med EMSA, är den begränsad i de fall där RNA-sond innehåller flera bindningsställen, eller råextraktet innehåller mer än en RNA-bindande proteiner som binder till sonden på samma plats. Medan flera RNA / proteininteraktioner kommer att undgå upptäckt av filtret-bindande analys, kan de lätt visualiseras genom EMSA. I vissa fall är visualisering even möjlig när två RNA / proteinkomplex co-migrate (till exempel, mänsklig IRP1 / IRE och IRP2 / IRE komplex), genom att lägga till en antikropp mot en av RNA-bindande proteiner till EMSA reaktionen, vilket ger ytterligare retardation på gelen ( "supershift") 7.
EMSA har i stor utsträckning använts för att studera IRP1 och IRP2, vilka är post-transkriptionsregulatorer av järn metabolism 8-10. De fungerar genom att binda till IRES, fylogenetiskt bevarade hårnålsstrukturer inom UTR flera mRNA 11. IRES upptäcktes först i mRNA kodar ferritin 12 och transferrinreceptor 1 (TfR1) 13, proteiner av järn lagring och upptag, respektive. Senare, IRES hittades i erytroid specifika aminolevulinat syntas (ALAS2) 14, mitokondrie aconitase 15, ferroportin 16, tvåvärd metall transportör 1 (DMT1) 17, hypoxi inducerbara faktor 2 <em> α (HIF2α) 18, och andra mRNA 19-21. Prototypen H- och L-ferritin mRNA innehåller en IRE i deras 5 'UTR, medan TfR1 mRNA innehåller flera IRES i sin 3' UTR. IRE / IRP interaktioner hämmar specifikt ferritin mRNA översättning steriskt blockera dess associering av de 43S ribosomala subenheten; dessutom de stabiliserar TfR1 mRNA mot endonukleolytisk klyvning. IRP1 och IRP2 dela omfattande sekvenslikhet och uppvisar hög IRE-bindande aktivitet i järn-svalt celler. I järn fylld celler, IRP1 monterar en cubane Fe-S kluster som omvandlar den till cytosoliska aconitase på bekostnad av dess IRE-bindande aktivitet, medan IRP2 undergår proteasomal nedbrytning. Således IRE / IRP interaktioner beror på den cellulära järnstatus, men är också regleras av andra signaler, som H 2 O 2, kväveoxid (NO) eller hypoxi. Här beskriver vi protokoll för bedömning IRE-bindande aktivitet från rå cell- och vävnadsextrakt från EMSA. Vi använde en 32 P-märkt H-ferritin IRE prob som genererades genom transkription in vitro från en plasmid DNA-mall (I-12.CAT), där IRE-sekvensen introducerades ursprungligen i sense orientering nedströms om T7-RNA-polymeras webbplats genom kloning av glödgad syntetiska oligonukleotider 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Häri beskriver vi ett protokoll som har utvecklats för att studera IRE-bindande aktiviteter IRP1 och IRP2, och vi visar representativa uppgifter. Genom att använda olika sonder, kan detta protokoll också justeras för att studera andra RNA-bindande proteiner. Ett kritiskt steg är storleken av sonden. Användning av långa sönder, vilket är vanligt när det exakta bindningsstället är okänt, kan resultera i RNA / proteinkomplex som migrerar inte annorlunda än den fria RNA. I detta fall är det tillrådligt att …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
Riferimenti
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
- Rio, D. C. . Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).
- Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5′ untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
- Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
- Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
- Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
- Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
- Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
- Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
- Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
- McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
- Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
- Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
- Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3′-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
- Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
- Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
- Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
- Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
- Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
- Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
- Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
- Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
- Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
- Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
- Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).
