טיפול של הכותנה העכברוש במחקרים להערכה טרום-הקלינית של וירוסי Oncolytic
Summary
Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.
Abstract
Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.
Introduction
וירוסי Oncolytic (OV) לשכפל באופן סלקטיבי בתאי גידול על ידי ניצול הבדלים ביוכימיים בין תאים נורמלים וסרטניים 1,2. ישנם שני סוגים של OVS: אלה שאינם דורשים מוטציה להשיג oncolysis סלקטיבית, המכונים וירוסי wild-type כמתרחשים באופן טבעי ואלה אשר חייבים להיות מהונדסים כדי להשיג oncolysis סלקטיבית. האוסף של מוטציות בתוך סוג גידול נתון קובע את אופי יתרון הצמיחה סלקטיבית על פני תאים נורמלים לOV 2. הבטיחות והתועלת של OVS באמצעות הודגמה בניסויים קליניים 3-7. למרות התקדמות בתחום virotherapy oncolytic קיימים פערים בין תוצאות פרה-קליניות וקליניות, המצביע על כך יש צורך במודלים טובים יותר להעריך את היעילות אנטי-הסרטנית של OVS.
סוג הווירוס ההרפס שור 1 (BHV-1) הוא חבר של משפחת הרפס, ותת-משפחת Alphaherpesviridae. BHV-1 initiates השור מורכב מחלה בדרכי הנשימה בבקר, מפגין במגוון רחב של תסמינים דומים 8,9 קר רע. BHV-1 נקשר קולטנים התקשרות וכניסה בשימוש על ידי HSV-1, כגון סולפט וnectin-1 10 heparan. עם זאת, הוא נקשר CD155 במקום של nectin-2 10. יש BHV-1 טווח מארח צר מאוד כך שהוא אינו יכול להיכנס ביעילות ובליזום שכפול בתאים עכבריים רגילים והפכו את 3,4,10. זה הופך את השימוש במודלים עכבריים קונבנציונליים בעייתי. קיבולת oncolytic של BHV-1 כבר הוכיחה במבחנה 11,12. BHV-1 הוכח ליזום שכפול ובלהרוג תאים סרטניים אנושיים ממגוון רחב של מקורות היסטולוגית, כוללים תאי סרטן השד וסרטן שד ייזום תאים 11,12. עם זאת, היכולת אנטי-הסרטנית של BHV-1 חייבת להיות מוערכת in vivo בהקשר של מארח עם מערכת חיסון תקין.
האדם Adenovirus (Ad), שליש 57 זנים אל מזוהים, בדרך כלל גורם למחלה בדרכי הנשימה בבני אדם. וקטורי Ad Oncolytic נבדקו ליעילות אנטי-הסרטנית שלהם עם כמה קידום לניסויים קליניים 13-15. למרות נתונים פרה-קליניים מבטיחים, תוצאות קליניות נפלו קצרות של ציפיות. מודלים xenograft גידול אנושי משמשים בדרך כלל כדי לחקור את היעילות אנטי-הסרטנית של וקטורי מודעות, למרות שהם מפגינים נחלשו מערכת חיסונית לווירוס 16,17. יתר על כן, מודלים עכבריים syngeneic הם אוֹסְרָנִי לזיהום מודעות, מה שהופכים את ההערכה של תגובות חיסוני מארח תוך שימוש במודלים אלה מעשיים 17,18.
המערכת החיסונית המארח זוהתה כמנגנון המשפיע ביותר על ידי שOVS להוציא מוות של תאים סרטניים 19. תגובות אנטי-סרטניות בין tolerized ואנטיגן גידולים הקשורים אינו tolerized דגמים (TAA) שונים ויכולות להשפיע על ההצלחה של טיפול OV מאוד. OV KM100 HSV-1 (ICP0 n212VP16 בשנת 1814 20) 20,21 עורר נסיגה של גידול ב -80% מעכברי נושאי גידול במודל סרטן שד אנטיגן Polyoma התיכון T העכברי 22. עם זאת, בדגמים / neu HER-2, היעילות אנטי-הסרטנית של KM100 נעה בין 20% רגרסיה מלאה בעכברי syngeneic וקיפאון בגידול מהונדס, HER2-tolerized עכברים. יחד נתונים אלה מדגישים את החשיבות של הערכה מלאה OVS באמצעות מודלים של בעלי חיים בצורה הטובה ביותר לשחזר את נוף החיסון האנושי כדי להבין מה תכונות שתקבענה את ההצלחה טיפולית.
החולדה הכותנה (hispidus Sigmodon), ילידי צפון אמריקה והדרום, היא נפוצה ביותר כמודל של זיהום בנגיף syncytial נשימה (כפי שנסקר ב5). חולדות כותנה משמשות גם במחקר חיסון נגד BHV-1 כפי שהם לשחזר את הפתולוגיה הקשורים למחלות בדרכי הנשימה שור מורכבות 6,23. יתר על כן, זיהום BHV-1 של חולדות כותנההוא חיסוני, גרימה רירית מתמשכים ותגובות חיסוניים מערכתיות 6,23-25. שורות תאים כבר נגזרו fibrosarcoma וosteosarcomas של בלוטת החלב (LCRT) והעצם (CCRT וVCRT), בהתאמה 26 ספונטניים. חולדות כותנה היו בשימוש כדי להעריך את יעילות in vivo של וקטורי Ad oncolytic כפי שהם רגישים לזיהום מודעות ולהפגין פתולוגיה דומה לבני האדם 27-29. השימוש במודלי מדוכאי חיסון להערכה טרום הקלינית של OVS הם לא רק פחות מעיד על תגובה הקלינית לטיפול, אבל הם אינם לוקחים בחשבון את תפקידה של מערכת החיסון בvirotherapy oncolytic 30,31. לכן, syngeneic והמודלים של עכברים כותנה-tolerized גידול של סרטן השד וסרטן עצמות הם מודלים רלוונטיים שבו להעריך את היעילות פרה-הקלינית של OVS, כגון BHV-1 ומודעות שלא ניתן ללמוד באמצעות מודלים עכבריים קונבנציונליים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cotton rats are highly excitable and have a strong flight response. Therefore, special care should be taken to minimize any undue stress on the animal. The cage setup described will allow for safe and easy capture of the animals, with the placement of the enrichment tube being of the utmost importance. When setting up cages, ensure that the enrichment tubes meet the size and shape requirements, and are placed in proper orientation in the cage. It is also important to ensure that any technicians who might be aiding in ani…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Breanne Cuddington holds a fellowship from the Canadian Breast Cancer Foundation. This work was sponsored by operating grants from the Cancer Research Society and the Canadian Cancer Society Research Institute (formerly the Canadian Breast Cancer Research Alliance). We thank Ann Tollefson (Saint Louis University School of Medicine) for LCRT cells and Dr. Kathleen Delaney and Marion Corrick for technical assistance with cotton rat housing and sedation.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965-092 | May use any brand |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Can prepare in lab, filter to sterilize | ||
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | May use any brand |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | May use any brand |
| Fetal bovine serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| T-150cm2 tissue culture flask | Fisher Scientific | 14-826-80 | May use any brand |
| 1X TypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| 12-well cell culture plate, flat bottom | Fisher Scientific | 08-772-29 | May use any brand, must be tissue culture treated |
| alamarBlue | Life Technologies | DAL1025 | May use an alternative reagent for determination of cell viability |
| 8640 Teklad 22/5 Rodent diet | Harlan | 8640 | |
| 1/8” corncob rodent bedding | Harlan | 7092 | |
| Nestlets | Ancare | – | Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable |
| 50 mL Conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | May use any brand, must be sterile |
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| 70% Ethanol | Can prepare in lab | ||
| 10 % Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | May use any brand |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments/Description |
| NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) | NAPCO | Model used not currently available | May use any brand |
| Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath | Fisher Scientific | Model used not currently available | May use any brand |
| Reichert Bright-line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | May use any brand |
| Typhoon Trio BioAnalyzer | GE Healthcare Life Sciences | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader | Tecan | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Allegra 6R benchtop centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| Table Top Anaesthesia machine | VetEquip | Model used not currently available | May use any brand, must be portable |
| Wahl Peanut Mini Clippers | Wahl | May use any brand of small clippers | |
| Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL | BD | 329464 | May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. |
| Cotton swabs | MedPro | 018-425 | May use any brand |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
Riferimenti
- Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7 (1), 34-45 (2008).
- Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254 (2), 178-216 (2007).
- Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78 (7), 3644-3653 (2004).
- Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63 (10), 1139-1142 (2001).
- Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
- Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11 (2), 79-91 (1998).
- Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
- Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8 (2), 187-205 (2007).
- Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26 (2), 303-321 (2010).
- Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66 (4), 453-455 (2004).
- Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20 (5), 282-289 (2013).
- Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88 (12), 6885-6895 (2014).
- Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14 (1), 107-117 (2006).
- Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62 (17), 4968-4976 (2002).
- Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12 (12), 1591-1593 (2001).
- Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), 3-5 (1994).
- Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110 (8), 1167-1170 (1992).
- Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (5), 1651-1655 (1991).
- Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30 (7), 658-670 (2012).
- Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74 (4), 2052-2056 (2000).
- Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76 (4), 1995-1998 (2002).
- Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12 (6), 1101-1110 (2005).
- Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78 (11), 2933-2943 (1997).
- Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17 (7-8), 933-943 (1999).
- Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222 (2), 299-309 (1996).
- Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13 (1), 123 (2006).
- Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16 (1), 139-146 (2005).
- Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
- Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369 (1), 131-142 (2007).
- Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22 (1), 123-131 (2014).
- Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19 (2), 335-344 (2011).
- Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), (1994).
