Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.
Gibson samling (GA) kloning tilbyder en hurtig, pålidelig og fleksibel alternativ til konventionelle DNA Cloning metoder. Vi brugte GA at oprette tilpassede plasmider til ekspression af eksogene gener i mus embryonale stamceller (mESCs). Ekspression af eksogene gener under kontrol af SV40 eller human cytomegalovirus promotorer aftager hurtigt efter transfektion ind mESCs. Et middel mod denne formindsket udtryk er at bruge den menneskelige elongeringsfaktor-1 alpha (hEF1α) promotor til at drive genekspression. Plasmidvektorer indeholder hEF1α er ikke så bredt tilgængelig som SV40- eller CMV-holdige plasmider, navnlig de også indeholder N-terminale 3xFLAG-tags. Den her beskrevne protokol er en hurtig metode til at skabe plasmider, der udtrykker FLAG-mærkede CstF-64 og CstF-64 mutant under udtryksmæssige regulering af hEF1α promotoren. GA anvender en blanding af DNA exonuclease, DNA-polymerase og DNA-ligase til at gøre kloning af overlappende ender af eventuelle DNA-fragmenter.Baseret på skabelonen DNA, vi havde til rådighed, designet vi vores konstruktioner at blive samlet til en enkelt sekvens. Vores design anvendt fire DNA-fragmenter: pcDNA 3.1 vektor backbone, hEF1α promoter del 1, hEF1α promoter del 2 (som indeholdt 3xFLAG-tag købt som et dobbeltstrenget syntetisk DNA-fragment), og enten CstF-64 eller specifik CstF-64 mutant. Sekvenserne af disse fragmenter blev overført til en primer generation værktøj til at udforme passende PCR-primere til frembringelse af DNA-fragmenter. Efter PCR blev DNA-fragmenter blandet med vektoren indeholdende den selektive markør, og GA kloning reaktionen blev samlet. Plasmider fra individuelle transformerede bakteriekolonier blev isoleret. Første skærmbillede af plasmiderne blev udført ved restriktionsfordøjelse efterfulgt af sekventering. Afslutningsvis GA tilladt os at oprette tilpassede plasmider til genekspression i 5 dage, herunder konstruere skærme og verifikation.
Konventionelle DNA Cloning procedurer afhængige af anvendelse af restriktionsenzymer til at spalte DNA og DNA-ligase at slutte sig til DNA-fragmenter sammen. Generering af brugerdefinerede ekspressionskonstruktioner indeholder forskellige DNA-fragmenter er en sekventiel procedure, der omfatter spaltning af DNA'et med et og / eller flere restriktionsendonucleaser og den efterfølgende indsættelse af DNA-fragmenter gennem ligering. Den største ulempe ved denne procedure er, at egnede restriktionsenzymer for en af de DNA-fragmenter kan være vanskeligt at identificere (dvs. kan have flere spaltningssteder) destruktion vellykket DNA kloning af fuldlængde-proteinet af interesse umulig. Derfor generation af brugerdefinerede ekspressionskonstrukter under transkriptionel regulering af effektiv celletype promotorer med tilpassede protein-tags kræver meget omhyggelig design. Det er også en tids- og arbejdskrævende teknik. For nylig, flere rapporter beskrevet metoder til at samle multiple forskellige syntetiske DNA-fragmenter i en kontinuerlig sekvens på samme tid i enten en- eller to-trins-reaktioner uden anvendelse af restriktionsenzymer 1-3. Den ene trin kloning reaktion (eksklusive alle forberedende trin), afhænger af brugen af en blanding af DNA exonuclease, DNA-polymerase, DNA-ligase 2,3 og de overlappende ender af DNA-fragmenter (figur 1). Da der ikke er brug af restriktionsenzymer kan DNA-fragmenter af en hvilken som helst størrelse og sekvens sammensætning (undtagen stærkt repetitive sekvenser) fusioneres sammen i en sømløs konstruktion. For nylig, et kommercielt kit (Gibson forsamlingsfriheden; GA) for de ét-trins kloning reaktioner blev tilgængelige. Dette sæt giver hurtig og omkostningseffektiv montage af eventuelle DNA-fragmenter i en enkelt vektor med tilpassede promotorer og protein tags.
De bredt tilgængelige plasmidekspressionsvektorer bruges til at udtrykke eksogene proteiner i mammale cellekultur modeller er ofte under transkriptionel regfolkning af det virale cytomegalovirus (CMV) eller abevirus 40 (SV40) promotorer. Disse virale promotorer giver robust forbigående ekspression af de exogene proteiner i de fleste mammale cellekultur baserede modeller. Imidlertid generering af cellelinjer, der stabilt udtrykker eksogene proteiner er ofte mislykket på grund af transkriptionel inaktivering af CMV eller SV40-promotorer under etablering proces 4,5. Desuden vil SV40 og CMV virale promotorer ikke i tilstrækkelig grad at fremme ekspression af exogene proteiner i celler fra den lymfoide afstamning eller embryonale stamceller 6,7. Løsningen på den iboende begrænsning af virale promotorer er at bruge stærke konstitutive ikke-virale promotorer 8-10. Et godt karakteriseret stærk konstitutiv ikke-viral promotor af human oprindelse er elongeringsfaktor 1α (hEF1α) promotor (hEF1α er involveret i katalyse af GTP-afhængige sammenslutning af aminoacyl-tRNA til ribosomer 11). Imidlertidekspressionsvektorer indeholdende hEF1α promotoren er ikke så bredt tilgængelig som den virale-promotoren indeholdende plasmider, især dem, der også indeholder 3 × FLAG på den aminoterminale ende af proteinet af interesse.
Den 64.000 MW spaltning stimulation faktor protein (CstF-64) er involveret i 3'-enden behandling af de fleste mRNA'er 12,13, herunder replikation-afhængige histon mRNA'er 14,15. CstF-64 udtrykkes i alle somatiske væv 12. Dens RNA genkendelsesmotiv binder til GU-rige RNA-sekvenser på spirende transkripter nedstrøms for spaltning og polyadenyleringsstedet 16. Denne binding af CstF-64 til præ-mRNA fremmer effektiv endonukleolytisk spaltning af den begyndte transcript.
Her er en protokol, der er beskrevet, der anvender PCR-amplifikation af DNA-fragmenterne til en Gibson samling kloning kit (som omfatter kemisk kompetente bakterieceller) producere brugerdefinerede vektorer af 3xFLAG-mærkede mOuse CstF-64 eller mutant CstF-64 til deres aminoterminale ende under ekspressionen af hEF1α promotoren 1.
Bør indledes vellykkede anvendelse af GA kloning altid ved en omhyggelig udformning af den komplette konstrukt (figur 2 og figur 3).
Omhyggelig kontrol af primersekvenserne designet af primeren generation værktøj er også stærkt anbefales. Primere til GA kan genereres uden brug af primeren generation værktøj. , Brug af værktøjet er dog anbefales, fordi det forenkler processen. Generelt skal primeren for GA kloning har to funktionelt forskellige sekvenser. Den første sekvens er DNA-fragment-specifikke og tillader amplificering af fragmentet ved hjælp af PCR. Den anden sekvens overlapper med den tilstødende fragment, som er nødvendig for GA samling. En typisk sekvens DNA-fragment-specifikke ville være 18-22 nt i længden. DNA-fragmentet specifikke sekvenser anvendt til at amplificere det samme DNA skal have lignende smeltetemperaturer og GC-indhold. Overlappende sekvens bør være mindst 15nt i længde med en smeltetemperatur på mindst 48 ° C. Samlingen af mere end 4 DNA-fragmenter vil kræve overlappende sekvens til at være mindst 20 nt. Længere overlapninger vil tillade øget specificitet annealing resulterer i mere korrekt samlet DNA-fragmenter. Det anbefales at undgå sekvenser, der er skæv i deres GC eller AT indhold i udviklingen overlappende sekvenser, fordi skæve sekvenser kan bringe korrekt DNA forsamling.
Vi foreslår også anvendelse som en negativ kontrol, som ikke bør have nogen lægemiddelresistente bakteriekolonier, blot DNA-fragmentet svarende til vektorrygraden i en GA reaktion. Alternativt en af DNA-fragmenter, der omfatter "indsatser" udelades fra GA reaktion, som også bør resultere i nogen resistente bakteriekolonier. Grunden ingen kolonier vil vokse vil være manglen på overlappende ender af tilstødende DNA-fragmenter, som vil gøre samling af rundete plasmid.
I beskrevne protokol overlappende sekvenser af 25 nt at generere primersæt blev anvendt på grund af antallet af DNA-fragmenter anvendes (figur 3). Anbefalingen af primeren generation værktøj hjemmeside (se tabel af udstyr) er at bruge mindst 20 nt overlappende sekvenser at samle 4 – 6 DNA-fragmenter. Desuden længere overlappende sekvens vil sikre korrekt komplementering af DNA-strengene (se figur 1) at øge antallet af nøjagtigt samlede produkter.
I øjeblikket flere systemer til problemfri kloning er tilgængelige. Men nogle af disse systemer stadig bruge restriktionsenzymer (dvs. Golden Gate kloning 18). Andre bruger proprietære blandinger af enzymer er baseret på vacciniavirus DNA-polymerase og enkeltstrenget DNA-bindende protein fra den samme biologiske kilde 19. Begge systemer er begrænset i forhold til GA ved Shorter længde af overlappende sekvenser. Fordi kortere overlappende sekvenser muligvis ikke tilvejebringe tilstrækkelig specificitet til udglødningstrin af tilgrænsende DNA-fragmenter, hvilket gør en korrekt samling af mere end 23 DNA-fragmenter problematisk. Disse mangler ikke er til stede i GA-systemet.
Størrelsen af de DNA-fragmenter, som skal amplificeres bør også overvejes for ikke at overskride den størrelse pålideligt amplificerbare ved hjælp af PCR (dvs. mindre end 8 kbp i længde). Selv med forbedringerne i funktion af DNA-polymeraser i de sidste 10 år vil store DNA-fragmenter amplificeres med mindre effektivitet og nøjagtighed. Hvis det er nødvendigt, kan større DNA-fragmenter opnået fra andre kilder alternativ til PCR, fx ved plasmid isolation og passende DNA fordøjelse med restriktionsenzymer. Specifikt for den protokol, der er beskrevet i den aktuelle manuskript vores rationelt at anvende PCR var baseret på størrelsen af de tilgængelige DNA-fragmenter, som var alle mindre end5 kbp. Hvis der er mere end én PCR-produkt identificeres ved agarosegelelektroforese anbefales gel oprensning af den ønskede fragment størrelse ved hjælp af enhver af de tilgængelige molekylærbiologiske teknikker eller passende kits. I den nuværende protokol anvendes en varmestabil DNA-polymerase (se tabel Materialer). Men enhver DNA-polymerase levere high fidelity og udbytte vil være egnet til brug med denne protokol. Hvis high-fidelity DNA-polymeraser forskellige end beskrevet i protokollen er tilgængelige, skal du bruge oprettet betingelser som beskrevet i de respektive vejledninger. I den nuværende protokol, kemisk kompetente E. coli celler anvendes som følger med GA kit. Alternativt kemisk eller elektro kompetente E. coli stammer, såsom DH5a eller DH10B kan anvendes.
Samlingen kloning 2x mester mix er let at bruge med minimale hands-on tid. Imidlertid er nøjagtig pipettering nødvendig på grund af de små mængder needed at blive blandet sammen. God molekylærbiologi teknik skal udnyttes på alle tidspunkter også.
GA kloning giver ubegrænsede muligheder for en konstruktion af DNA-fragmenter, plasmider og vektorer, som er længere end 3 kbp i størrelse. Desuden har det en større indvirkning på syntetisk biologi, fordi det giver mulighed for syntese og samling af for eksempel en hel bakterie (Mycoplasma mycoides) genom eller en gær (Saccharomyces cerevisiae) kromosom 20,21. Teknikken kan også anvendes til konventionel kloning skal generere sømløse konstruktioner.
Afslutningsvis GA kloning tilbyder hurtig, pålidelig og fleksibel alternativ til den konventionelle DNA Cloning procedure.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Michaela Jansen ved Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, TX og Mladen Yovchev ved University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA for generøst at give pcDNA 3.1 myc-His (A) og hEF1α promotor, der indeholder plasmider . Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development af National Institutes of Health under tildeling nummer R01HD037109 (til CCM). Yderligere støtte var fra Laura W. Bush Institute for kvinders sundhed (til CCM og PNG). Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) | Integrated DNA Technologies | We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available. | |
DNA purification magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification system |
Plasmid Isolation Mini Kit | Omega Bio-Tek Inc | D6942-01 | E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5510S | |
DNA polymerase | New England BioLabs | M0494S | Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix |
DpnI | New England BioLabs | R0176S | |
NheI | New England BioLabs | R3131S | |
NotI | New England BioLabs | R3189S | |
HindIII | New England BioLabs | R3104S | |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop device | |
EditSeq | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
SeqBuilder | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
Word | Microsoft | Part of Microsoft Office | |
NEBuilder | New England BioLabs | primer generation tool: http://nebuilder.neb.com | |
NEBioCalculator | New England BioLabs | ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation |