Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.
Gibson montering (GA) kloning erbjuder en snabb, pålitlig och flexibelt alternativ till konventionella DNA kloningsmetoder. Vi använde GA att skapa anpassade plasmider för uttryck av exogena gener i möss embryonala stamceller (mESCs). Expression av exogena gener under kontroll av SV40 eller humant cytomegalovirus promotorer minskar snabbt efter transfektion in mESCs. En åtgärd för detta minskade uttrycket är att använda den humana förlängningsfaktor-1 alfa (hEF1α) promotorn för att driva genuttryck. Plasmidvektorer innehåller hEF1α är inte så tillgänglig som SV40- eller CMV-innehållande plasmider, särskilt de som även innehåller N-terminala 3xFLAG-taggar. Protokollet som beskrivs här är en snabb metod för att skapa plasmider som uttrycker FLAG-märkt CstF-64 och CstF-64 mutant under uttrycks reglering av hEF1α promotorn. GA använder en blandning av DNA-exonukleas, DNA-polymeras och DNA-ligas för att göra kloning av överlappande ändar av DNA-fragment möjlig.Baserat på de mall-DNA som vi hade tillgängliga, utformade vi våra konstruktioner som ska monteras till en enda sekvens. Vår design används fyra DNA-fragment: pcDNA 3.1 vektor ryggraden, hEF1α promotor del 1, hEF1α promotor del 2 (som innehöll 3xFLAG-tagg köpas som ett dubbelsträngat syntetiskt DNA-fragment), och antingen CstF-64 eller specifik CstF-64 mutant. Sekvenserna av dessa fragment matades in i en primer generation verktyg för att utforma lämpliga PCR-primrar för generering av DNA-fragment. Efter PCR, DNA-fragment blandades med vektorn som innehåller den selektiva markören och GA kloningsreaktionen sattes samman. Plasmider från enskilda transformerade bakteriekolonier isolerades. Initial skärm av plasmider gjordes genom restriktionsklyvning, följt av sekvensering. Sammanfattningsvis GA tillät oss att skapa anpassade plasmider för genuttryck i 5 dagar, inklusive konstruera skärmar och verifiering.
Konventionella DNA-kloningsförfaranden förlitar sig på användningen av restriktionsenzymer för att klyva DNA och DNA-ligas för att förena DNA-fragmenten tillsammans. Generering av anpassade expressionskonstruktioner innehållande olika DNA-fragment är en sekventiell procedur som innefattar spaltning av DNA med ett och / eller flera restriktionsendonukleaser och efterföljande insättning av DNA-fragment genom ligering. Den stora nackdelen med detta förfarande är att lämpliga restriktionsenzymer för en av de DNA-fragment kan vara svårt att identifiera (dvs. kan ha flera klyvningsställen) gör framgångsrika DNA kloning av fullängdsprotein av omöjligt intresse. Därför generation av anpassade uttryckskonstruktioner under transkriptionsreglering av effektiv cell typspecifika promotorer med anpassade protein-taggar kräver mycket noggrann design. Det är också ett tids- och arbetskrävande teknik. Nyligen, flera rapporter beskrivna metoder för att montera Multiple olika syntetiska DNA-fragment i en kontinuerlig sekvens samtidigt i antingen en- eller två-stegsreaktioner utan användning av restriktionsenzymer 1-3. Den ett steg kloning reaktion (exklusive alla förberedande steg), beroende på användningen av en blandning av DNA-exonukleas, DNA-polymeras, DNA-ligas 2,3 och de överlappande ändarna av DNA-fragment (Figur 1). Eftersom det inte finns någon användning av restriktionsenzymer, kan DNA-fragment av vilken storlek som helst och sekvenskomposition (exklusive höggradigt repetitiva sekvenser) smältas samman i en sömlös konstruktion. Nyligen, ett kommersiellt kit (Gibson församling; GA) för enstegs kloning reaktioner blev tillgängliga. Detta kit möjliggör snabb och kostnadseffektiv montering av eventuella DNA-fragment i en enda vektor med skräddarsydda tagare och protein taggar.
De allmänt tillgängliga plasmidexpressionsvektorer används för att uttrycka exogena proteiner i däggdjurscellodlingsmodeller är ofta under transkriptions reglering av det virala cytomegalovirus (CMV) eller simianvirus 40 (SV40) promotorer. Dessa virala promotorer ger robusta transient expression av de exogena proteinerna i de flesta däggdjurscellodlings baserade modeller. Dock är generering av cellinjer stabilt uttrycker exogena proteiner ofta misslyckas på grund av transkriptionstyst av CMV eller SV40 tagare under etableringsprocessen 4,5. Dessutom kommer de SV40 och CMV virala promotorer inte tillräckligt främja expressionen av exogena proteiner i celler från lymfoid härstamning eller embryonala stamceller 6,7. Lösningen på den inneboende begränsningen av virala promotorer är att använda starka konstitutiva icke-virala promotorer 8-10. En välkarakteriserad starka konstitutiva icke-viral promotor av humant ursprung är den elongeringsfaktor 1α (hEF1α) promotor (hEF1α är inblandad i katalysen av GTP-beroende association av aminoacyl-tRNA till ribosomer 11). Emellertidexpressionsvektorer innehållande hEF1α promotorn är inte lika allmänt tillgänglig som den virala-promotorn innehållande plasmider, speciellt sådana innehållande också 3 × FLAG vid den aminoterminala änden av proteinet av intresse.
Den 64.000 MW klyvning stimulering faktorproteinet (CstF-64) är inblandad i 3 'änden bearbetning av de flesta mRNA 12,13, inklusive replikationsberoende histon mRNA 14,15. CstF-64 uttrycks i alla somatiska vävnader 12. Dess RNA igenkänningsmotiv binder till GU-rika RNA-sekvenser på begynnande avskrifter nedströms klyvning och polyadenyleringsstället 16. Denna bindning av CstF-64 till pre-mRNA främjar effektiv endonukleolytisk klyvning av begynnande avskriften.
Här används en protokoll som beskrivits som använder PCR-amplifiering av DNA-fragmenten, till en Gibson monteringskloningskit (som inkluderar kemiskt kompetenta bakterieceller) producera anpassade vektorer 3xFLAG-taggade mOuse CstF-64 eller mutant CstF-64 till deras aminoterminaländen under uttrycket av hEF1α promotor 1.
Framgångsrik användning av GA kloning bör alltid föregås av en noggrann utformning av hela konstruktionen (Figur 2 och Figur 3).
Noggrann kontroll av primersekvenserna designade av primern generation verktyg är också rekommenderas. Primrar för GA kan genereras utan användning av primern generation verktyg. Dock är användningen av verktyget rekommenderar, eftersom det förenklar processen. Generellt måste primer för GA kloning har två funktionellt olika sekvenser. Den första sekvensen är DNA-fragment-specifik, och tillåter amplifiering av fragmentet med användning av PCR. Den andra sekvensen överlappar med den intilliggande fragmentet, vilket är nödvändigt för GA montering. En typisk DNA-fragment-specifika sekvensen skulle vara 18-22 nt i längd. DNA-fragment som specifika sekvenser användes för att amplifiera samma DNA måste ha liknande smälttemperaturer och GC-innehåll. Överlappande sekvens bör vara minst av 15nt i längd med en smälttemperatur av minst 48 ° C. Hopsättningen av mer än fyra DNA-fragment kommer att kräva den överlappande sekvensen att vara åtminstone 20 nt. Längre lappningar kommer att möjliggöra ökad specificitet för glödgning vilket resulterar i mer korrekt monterade DNA-fragment. Det rekommenderas att undvika sekvenser som är skeva i sin GC eller AT innehåll i utvecklingen lappande sekvenser, eftersom skeva sekvenser kan äventyra korrekt DNA montering.
Vi föreslår också att använda som en negativ kontroll, som inte bör ge några läkemedelsresistenta bakteriekolonier, bara det DNA-fragment som motsvarar vektor ryggraden i en GA reaktion. Alternativt kan en av de DNA-fragment som omfattar de "skär" kan utelämnas från GA reaktionen, vilket också bör resultera i några läkemedelsresistenta bakteriekolonier. Anledningen inga kolonier kommer att växa kommer att vara brist på överlappande ändarna av de angränsande DNA-fragment, vilket kommer att göra monteringen av en komplete plasmiden.
I beskrivna protokollet, överlappande sekvenser av 25 nt att alstra de primeruppsättningar användes, på grund av antalet av DNA-fragment användas (figur 3). Rekommendationen av primern generation verktyg webbplats (se tabell i Equipment) är att använda minst 20 nt lappande sekvenser att montera 4 – 6 DNA-fragment. Dessutom längre lappande sekvens kommer att säkerställa en korrekt komplettering av DNA-strängarna (se figur 1) öka antalet korrekt monterade produkter.
För närvarande flera system för sömlös kloning finns. Men vissa av dessa system fortfarande använda restriktionsenzymer (dvs, Golden Gate kloning 18). Andra använder egna blandningar av enzymer som bygger på vacciniavirus DNA-polymeras och enkelsträngat DNA-bindande protein från samma biologisk källa 19. Båda systemen är begränsade i jämförelse med GA av schorter längden av överlappande sekvenser. Eftersom kortare lappande sekvenser inte kan ge tillräcklig specificitet till glödgningssteget av intilliggande DNA-fragment, vilket gör den lämplig montering av mer än 23 DNA-fragment problematiska. Dessa brister är inte närvarande i den GA-systemet.
Storleken av DNA-fragmenten som skall förstärkas bör också vara så att den inte överstiger storleken tillförlitligt amplifierbara genom PCR (dvs mindre än 8 kbp i längd). Även med de förbättringar i funktionen av DNA-polymeraser under de senaste 10 åren kommer stora DNA-fragment amplifieras med mindre effektivitet och noggrannhet. Om det behövs kan större DNA-fragment erhållas från andra källor alternativa PCR, exempelvis genom att plasmid isolering och lämplig DNA uppslutning med restriktionsenzymer. Specifikt för det protokoll som beskrivs i den aktuella manuskriptet, vår rationellt att använda PCR baserat på storleken av de tillgängliga DNA-fragment, som var alla mindre än5 kbp. Om det finns fler än en PCR-produkt som identifieras med hjälp av agarosgelelektrofores, är gelrening av det önskvärda fragmentet storlek som rekommenderas användning av någon av de tillgängliga molekylärbiologiska tekniker eller lämpliga kit. I det nuvarande protokollet ett värmestabilt DNA-polymeras används (se tabell för material). Men någon DNA-polymeras som ger hifi och avkastning kommer att vara lämpliga att användas med detta protokoll. Om high-fidelity DNA-polymeraser annorlunda än beskrivs i protokollet finns, använd inrätta villkor som anges i respektive handböcker. I det nuvarande protokollet, kemiskt kompetent E. coli celler används som medföljer GA kit. Alternativt, kemiskt eller elektrokompetenta E. coli-stammar såsom DH5a eller DH10B kan användas.
Aggregatet kloning 2x Master Mix är lätt att använda med minimala praktisk tid. Emellertid är noggrann pipettering krävs på grund av de små volymer neEDED att blandas ihop. Bra molekylärbiologi teknik måste utövas på alla gånger också.
GA kloningen erbjuder obegränsade möjligheter för en konstruktion av DNA-fragment, plasmider och vektorer, som är längre än 3 kbp i storlek. Dessutom har den ett bredare genomslag inom syntetisk biologi, eftersom det tillåter syntes och montering av t.ex. en hel bakteriell (Mycoplasma mycoides) genomet eller en jäst (Saccharomyces cerevisiae) kromosom 20,21. Tekniken kan också tillämpas på konventionell kloning behöver för att alstra sömlösa konstruktioner.
Sammanfattningsvis erbjuder GA kloning snabbt, pålitligt och flexibelt alternativ till den konventionella DNA-kloningsförfarandet.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Michaela Jansen vid Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, TX och Mladen Yovchev vid University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA för generöst ger pcDNA 3.1 myc-His (A) och hEF1α promotor som innehåller plasmider . Forskningen rapporteras i denna publikation stöddes av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development av National Institutes of Health i utmärkelsen nummer R01HD037109 (till CCM). Ytterligare stöd kom från Laura W. Bush institutet för kvinnors hälsa (till CCM och PNG). Innehållet är ensamt ansvar författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) | Integrated DNA Technologies | We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available. | |
DNA purification magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification system |
Plasmid Isolation Mini Kit | Omega Bio-Tek Inc | D6942-01 | E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5510S | |
DNA polymerase | New England BioLabs | M0494S | Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix |
DpnI | New England BioLabs | R0176S | |
NheI | New England BioLabs | R3131S | |
NotI | New England BioLabs | R3189S | |
HindIII | New England BioLabs | R3104S | |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop device | |
EditSeq | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
SeqBuilder | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
Word | Microsoft | Part of Microsoft Office | |
NEBuilder | New England BioLabs | primer generation tool: http://nebuilder.neb.com | |
NEBioCalculator | New England BioLabs | ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation |