3-D Imaging en Analyse van Neuronen Infected<em> In Vivo</em> Met<em> Toxoplasma gondii</em
Summary
Met dit protocol, konden we beeld 160 pm dikke hersencoupes van muizen geïnfecteerd met de parasiet Toxoplasma gondii, die visualisatie en analyse van de ruimtelijke relatie tussen de encysting parasiet besmette neuron maakt.
Abstract
Toxoplasma gondii is een obligaat intracellulaire parasiet met een breed gastheerbereik, waaronder mensen en knaagdieren. In zowel mensen als knaagdieren, Toxoplasma wordt een levenslange persistente infectie in de hersenen. Hoewel deze hersenen infectie asymptomatisch meeste immunocompetente mensen, voor de foetus of immuungecompromitteerde personen, zoals verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS) patiënten deze voorkeur voor en persistentie in de hersenen kan leiden tot verwoestende neurologische ziekte. Het is dus duidelijk dat de hersen- Toxoplasma interactie is essentieel voor de symptomatische ziekte door Toxoplasma, maar we hebben weinig begrip van de cellulaire en moleculaire interacties tussen cellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) en de parasiet. In het muismodel van CNS toxoplasmose het is bekend dan 30 jaar dat neuronen de cellen waarin de parasiet aanhoudt, maar weinig informatie beschikbaar over welkedeel van het neuron wordt over het algemeen besmet (soma, dendriet, axon) en als dit cellulaire relatie verandert tussen stammen. Deels dit gebrek ondergeschikt is aan de moeilijkheid van beeldvorming en visualiseren gehele geïnfecteerde neuronen van een dier. Dergelijke beelden zou vergen doorgaans seriële snijden en stikken van weefsel in beeld gebracht met behulp van elektronenmicroscopie of confocale microscopie na immunostaining. Door het combineren van verschillende technieken, de hier beschreven werkwijze maakt het gebruik van dikke secties (160 urn) te identificeren en het gehele cellen die cysten bevatten, zodat driedimensionale visualisatie en analyse van individuele, chronisch geïnfecteerde neuronen zonder immunokleuring, elektronenmicroscopie , of seriële snijden en stikken. Met deze techniek kunnen we beginnen de cellulaire relatie tussen de parasiet en de geïnfecteerde neuron begrijpen.
Introduction
Het algemene doel van deze methode is in een hoge resolutie, drie-dimensionale beelden van individuele neuronen die zijn geïnfecteerd met het obligate intracellulaire parasiet Toxoplasma gondii verkrijgen.
Toxoplasma wordt vaak beschouwd als een van de meest succesvolle parasieten vanwege zijn grote tussengastheer serie, die mensen en knaagdieren bevat. Bij zowel mensen en knaagdieren, na acute infectie door het eten van besmet voedsel of water, Toxoplasma is in staat om een persistente infectie van het CZS veroorzaakt door het omzetten van zijn snelle replicerende vorm (de tachyzoite) om de trage-vermeerderingsfase encysting vorm (de bradyzoite ). In immuuncompetente individuen, wordt dit latente CNS infectie gedacht relatief asymptomatisch zijn, maar in immuungecompromitteerde personen zoals AIDS patiënten of ontvangers, kan weer uitbreken van de parasiet tot fatale encefalitis toxoplasmic 1,2. Daarnaast recente studies have aangetoond dat latente infectie met Toxoplasma kan leiden tot gedragsveranderingen bij knaagdieren 3,4, hoewel het mechanisme blijft onbekend.
Verrassend, ondanks deze gegevens benadrukken het belang van het CNS- Toxoplasma interactie, relatief weinig bekend is over deze relatie, in het bijzonder op cellulair en moleculair niveau. De mogelijkheid om zelfs eenvoudige aspecten van de interactie hersenen-parasiet bestuderen is deels belemmerd door technologische beperkingen. Bijvoorbeeld, het merendeel van het werk blijkt dat neuronen de cellen waarin cysten blijven is gedaan met elektronenmicroscopie (EM) 5,6. Hoewel EM geeft hoge resolutie, het is tijdrovend, arbeidsintensief en duur. Immunofluorescentie (IF) assays zijn onlangs gebruikt in combinatie met confocale microscopie met het werk van EM 7 bevestigen. IF testen zijn technisch eenvoudig uit te voeren en relatief goedkoop, maar met behulp van deze technieken understand de ruimtelijke relatie tussen de cyste en de besmette neuron vereist seriële reconstructie, dat is tijdrovend, technisch moeilijk, en kan leiden tot verlies van waardevolle informatie. Aldus hebben we een methode die kan worden gebruikt met het muismodel van CNS toxoplasmose en laat ons beeld de gehele geïnfecteerde neuronen zonder EM of immunohistochemie (IHC) ontwikkeld. Door het ontwikkelen van een dergelijke techniek, kunnen we beginnen de cellulaire relatie tussen de geïnfecteerde cel en de cyste in een relatief snelle en goedkope wijze verkennen.
De methode die we ontwikkeld combineert nieuwere technieken voor het optisch clearing en imaging dikke hersensecties door confocale microscopie 8 met een systeem dat markeert in vivo cellen die zijn ingespoten met parasiet eiwitten 9,10. In dit systeem infecteren we Cre-reporter muizen die een groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie na Cre gemedieerde recombinatie 11 met Toxoplasma </em> Stammen die een rood fluorescerend eiwit (RFP) te uiten en te injecteren Cre recombinase in gastheercellen 9. Deze combinatie stelt ons in staat om de geïnfecteerde muizenhersenen oogsten na CNS infectie is vastgesteld, snijd dikke hersenen secties, en snel te identificeren relevante gebieden om het beeld door het vinden van de RFP + cysten. Het is belangrijk op te merken dat als gastheercel expressie van GFP alleen afhankelijk injectie van Cre door parasieten, en niet op infectie, een aantal GFP + cellen niet parasieten 10 bevatten. Als het doel van dit protocol is om te kunnen het hele geïnfecteerde neuronen, de focus is alleen op GFP + neuronen die ook een RFP + cyste bevatten, maar het protocol kan ook worden gebruikt voor het imago van de GFP + / RFP – neuronen.
Zodra de besmette hersenen wordt geoogst en gesegmenteerd, worden de secties transparant gemaakt door glycerol clearing. Geschikte gebieden van de secties worden vervolgens afgebeeld met confocale microscopie, algende ongekende visualisatie van geïnfecteerde gastheercellen en de ingekapselde parasieten in hun geheel. Hier bieden we een compleet protocol voor het identificeren, optisch clearing, en imaging geïnfecteerde neuronen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aangezien cellulaire veranderingen in geïnfecteerde gastheercellen zijn gekoppeld aan de ziektebeelden bij infecties met andere intracellulaire organismen zoals HIV, hondsdolheid en Chlamydia 18,19, ontwikkelden we een techniek waarmee we de intieme interacties die optreden tussen de CNS bestuderen gastheercel en Toxoplasma. De hier beschreven methode Dit doel wordt bereikt doordat efficiënte beeldvorming van chronisch geïnfecteerde neuronen. Voorafgaand aan de ontwikkeling van deze methode, zoals…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de hele Koshy lab voor nuttige discussies. Wij danken Patty Jansma en de Universiteit van Arizona Neuroscience afdeling voor advies en hulp met beeldvorming. We danken ook de Porreca lab voor het gebruik van hun Vibratome. Dit onderzoek werd gesteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH NS065116, AAK).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| 200mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible – used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
Riferimenti
- Luft, B., Remington, J. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).
- Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).
- Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance. PloS one. 8 (9), 75246 (2013).
- Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats. Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).
- Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study. Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).
- Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study. J Neuroparasitology. , (2010).
- Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. (53), (2011).
- Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions. Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).
- Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade. PLoS pathog. 8 (7), (2012).
- Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites. PLoS pathog. 9 (5), (2013).
- Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host. Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).
- Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .
- Prandota, J. Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).
- Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis. PloS one. 6 (12), 28925 (2011).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice. Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).
- De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).
- Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice. J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
