הדמיה 3-D וניתוח של נוירונים נגועים<em> In vivo</em> עם<em> Toxoplasma gondii</em
Summary
השימוש בפרוטוקול זה, הצלחנו חלקים במוח העבה מיקרומטר 160 תמונה מעכברים נגועים בטפיל טוקסופלזמה גונדי, המאפשר הדמיה וניתוח של היחסים מרחביים בין טפיל encysting ונוירון הנגוע.
Abstract
Toxoplasma gondii הוא טפיל לחייב, תאית עם מגוון רחב מארח, כולל בני אדם ומכרסמים. בשני בני האדם ומכרסמים, Toxoplasma קובע זיהום מתמשך לכל החיים במוח. בעוד זיהום מוח זה הוא ללא תסמינים ברוב האנשים עם מערכת חיסון, בעובר המתפתח או אנשים מדוכאי חיסון כגון תסמונת כשל חיסוני נרכשת חולים (איידס), נטייה זו ולהתמדה במוח יכול להוביל למחלות נוירולוגיות הרסניות. לפיכך, ברור כי האינטראקציה Toxoplasma המוחין היא קריטית למחלה סימפטומטית המיוצרת על ידי Toxoplasma, עדיין יש לנו מעט הבנה של האינטראקציה הסלולרית או מולקולרית בין התאים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) וטפיל. במודל העכבר של מערכת העצבים המרכזית טוקסופלזמוזיס זה כבר ידוע במשך 30 שנים שהנוירונים הם התאים שבו הטפיל נמשך, אך מעט מידע זמין על שחלק מתא העצב בדרך כלל נגוע (סומה, דנדריט, אקסון) ואם מערכת יחסים סלולריים זה משתנה בין זנים. בחלקו, חוסר זה הוא משניים לקושי של הדמיה חזותי נוירונים נגועים כולו מבעלי חיים. תמונות כאלה בדרך כלל ידרשו חתך ותפרים של רקמה צילמה על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים או confocal לאחר immunostaining סדרתי. על ידי שילוב של מספר טכניקות, השיטה המתוארת כאן מאפשרת השימוש בחלקים עבים (160 מיקרומטר) כדי לזהות ותאי תמונה שלמה המכילים ציסטות, המאפשר הדמיה וניתוח של נוירונים בודדים, נגועים כרוני תלת-ממדיים ללא הצורך בimmunostaining, מיקרוסקופיה אלקטרונית , או חתך סידורי ותפרים. שימוש בטכניקה זו, אנו יכולים להתחיל להבין את הקשר בין סלולארי הטפיל ונוירון הנגוע.
Introduction
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשיג ברזולוציה גבוהה, תמונות תלת ממדיות של נוירונים בודדים שנדבקו בטפיל תאיים לחייב Toxoplasma gondii.
Toxoplasma נחשב לאחד מהטפילים המצליחים ביותר לעתים קרובות בגלל מגוון הגדול שלה ביניים מארח, הכולל בני אדם ומכרסמים. בשני בני אדם ומכרסמים, לאחר זיהום חריף בבליעה של מזון או מים מזוהמים, Toxoplasma הוא מסוגל לגרום לזיהום מתמשך של מערכת העצבים המרכזית על ידי המרה מצורתו מהירה משכפלת (tachyzoite) לאיטי המשכפל וencysting טופס (bradyzoite ). אצל אנשים עם מערכת חיסון תקינים, הוא חשב זיהום במערכת העצבים המרכזית סמוי זה להיות יחסית ללא תסמינים, אבל אצל אנשים מדוכאי חיסון כגון חולי איידס או מושתלים, התפרצות מחודשת של הטפיל עלולה לגרום לדלקת קרום מוח toxoplasmic הקטלנית 1,2. בנוסף, מחקרים שנעשה לאחרונה חההוכיח כי זיהום סמוי עם Toxoplasma יכול להוביל לשינויים התנהגותיים במכרסמים 3,4, אם כי המנגנון אינו ידוע.
באופן מפתיע, למרות נתונים אלה מדגישים את החשיבות של האינטראקציה CNS- Toxoplasma, קטן יחסית ידוע על הקשר הזה, במיוחד ברמה התאית ומולקולרית. היכולת ללמוד היבטים אפילו פשוטים של האינטראקציה המוח-טפיל כבר הקשתה בחלקו על ידי מגבלות טכנולוגיות. לדוגמא, רוב העבודה שהראה כי תאי עצב הם התאים שבי ציסטות להתמיד נעשתה עם מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) 5,6. למרות EM נותן ברזולוציה גבוהה, שזה זמן רב, עבודה אינטנסיבית, ויקר. לאחרונה Immunofluorescence מבחני (IF) היו בשימוש בשילוב עם מיקרוסקופיה confocal כדי לאשר את העבודה שנעשתה על ידי 7 EM. אם מבחני הם קלים מבחינה טכנית לבצע וזולים יחסית, אך תוך שימוש בטכניקות אלה לאחורייםtand הקשר המרחבי בין ציסטה ונוירון הנגוע דורש שיקום סדרתי, שזה זמן רב, קשה מבחינה טכנית, ועלול להוביל לאובדן של מידע בעל ערך. לפיכך, פיתחנו שיטה שיכול לשמש עם מודל העכבר של טוקסופלזמוזיס CNS ומאפשרת לנו תמונת השלמות של תאי עצב נגועים ללא EM או אימונוהיסטוכימיה (IHC). על ידי פיתוח טכניקה כזו, אנחנו יכולים להתחיל לחקור את מערכת היחסים בין סלולארי התא הנגוע וציסטה באופן מהיר יחסית ולא יקר.
השיטה שפיתחנו משלבת טכניקות חדשות לסליקה אופטית וחלקים במוח עבים הדמיה על ידי מיקרוסקופ confocal 8 עם מערכת שמסמנת בתאי vivo שכבר הזריקו עם חלבוני טפיל 9,10. במערכת זו, אנו להדביק עכברי Cre-כתב שמבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) רק לאחר Cre בתיווך רקומבינציה 11 עם Toxoplasma </em> זנים המבטאים חלבון אדום פלורסנט (RFP) ולהזריק recombinase Cre לתאי מארח 9. שילוב זה מאפשר לנו לקצור את מוח העכבר הנגוע לאחר הדבקת CNS הוקמה, לחתוך חלקים במוח עבים, ולזהות במהירות אזורים רלוונטיים לתמונה על ידי מציאת RFP + ציסטות. חשוב לציין כי כביטוי תא המארח של GFP תלוי אך ורק בהזרקה של Cre על ידי טפילים, ולא על זיהום, מספר תאי GFP + אינם מכיל טפילי 10. כמטרה של פרוטוקול זה היא להיות מסוגל נוירונים נגועים תמונה כולה, הדגש הוא רק על GFP + תאי עצב שמכיל גם RFP + ציסטה, אלא גם את הפרוטוקול יכול לשמש לתמונת GFP + / RFP – נוירונים.
ברגע שהמוח הנגוע שנקטפו ומחולק, הקטעים ניתנים על ידי שקופים סליקת גליצרול. אזורים מתאימים סעיפים לאחר מכן צילמו עם מיקרוסקופ confocal, אלהדמיה חסרת תקדים געיית תאי מארח נגועים וטפילי ביצת הקיימא בשלמותם. כאן אנו מספקים פרוטוקול מלא לזיהוי, סליקה אופטית, ונוירונים הדמיה נגועה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהתחשב בכך ששינויים תאיים בתאי מארח נגועים נקשרו לתוצאות מחלה בזיהומים עם אורגניזמים תאיים אחרים כגון HIV, כלבת, וכלמידיה 18,19, שפיתחנו טכניקה שתאפשר לנו ללמוד את יחסי הגומלין האינטימיים המתרחשים בין מערכת העצבים המרכזית לארח תא וToxoplasma. השיטה המתוארת כאן מש?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למעבדת הקושי הזה כולו לדיונים מועילים. אנו מודים לפטי Jansma ואוניברסיטת אריזונה Neuroscience המחלקה לייעוץ ועזרתי בהדמיה. אנו מודים גם למעבדה Porreca לשימוש Vibratome. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות (NIH NS065116, AAK).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| 200mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible – used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
Riferimenti
- Luft, B., Remington, J. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).
- Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).
- Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance. PloS one. 8 (9), 75246 (2013).
- Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats. Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).
- Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study. Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).
- Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study. J Neuroparasitology. , (2010).
- Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. (53), (2011).
- Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions. Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).
- Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade. PLoS pathog. 8 (7), (2012).
- Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites. PLoS pathog. 9 (5), (2013).
- Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host. Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).
- Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .
- Prandota, J. Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).
- Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis. PloS one. 6 (12), 28925 (2011).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice. Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).
- De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).
- Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice. J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
