生物発光イメージングが続くマウス皮下モデルにおける医学関連の異物にカンジダ·アルビカンスバイオフィルム発展
Summary
We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
Abstract
生物的および/ または非生物表面上のカンジダ·アルビカンスのバイオフィルムの開発は、入院患者のための具体的な脅威を表します。これまでのところ、C.アルビカンスのバイオフィルムは、 インビトロで 、主に研究されてきたが、 インビボ条件下で 、この動的なプロセスをよりよく理解するための重要な必要性がある。私たちは、Cを勉強するin vivoでの皮下ラットモデルを開発しましたalbicansのバイオフィルム形成 。我々のモデルで、（9までの）多数のカンジダ感染したデバイスは、動物の背中部分に注入される。それは私たちが一匹で複数の独立したバイオフィルムを研究することができますように、これは中心静脈カテーテルのモデルシステムを介して私たちに大きな利点を提供します。最近、我々はC.を研究するこのモデルを適応BALB / cマウスにおけるアルビカンスバイオフィルムの発達。本モデルで、C成熟アルビカンスバイオフィルムは48時間以内に発症し、典型的な3次元バイオフィルムのアーキテクチャを示しています。真菌のバイオフィルムの定量化伝統的に死後に分析し、ホスト犠牲を必要としている。これは速度論的研究を行うために多くの動物を使用する必要があるため、我々は、長手方向に成熟で、生体内フォローアップまでの非侵襲的生物発光イメージング（BLI）を適用私たちの皮下モデルで開発アルビカンスバイオフィルム。C. albicansの細胞は細胞壁に付着ガウヨモギルシフェラーゼ遺伝子（Glucを ） を発現するように操作した。生物発光シグナルを測定することができる光に加え、基質セレンテラジン変換ルシフェラーゼによって生成される。 BLI信号が外植カテーテルから得られた細胞数に似ていた。 in vivoでのバイオフィルム形成に定量化するための非侵襲的イメージングは、より良い理解するために、ここに貢献だけでなく、宿主-病原体相互作用に基づいて、研究のためのインビボ条件下でスクリーニングし、抗真菌薬の検証のための即時のアプリケーションを提供し、カテーテル関連感染症の病因のる。
Introduction
カンジダは皮膚や消化管及び膣内フローラの一部として、たとえば、健康な個体の異なるサイトで見ることができるの共生生物、ある。しかし、入院、および特に患者の免疫無防備状態は、感染1の広い範囲を引き起こす可能性がある。そのような個体では、免疫力が低下し、 カンジダ細胞が血流に普及し、生命を脅かす感染を引き起こすより深い組織に侵入することができます。また、中心静脈および尿道カテーテルなどの非生物基質の存在は、人工心臓弁、関節、 カンジダアタッチメント 2のためのニッチを提供することができる。そのような基材への密着性は、主に多糖類2からなる、細胞外の高分子材料に埋め込 まれた酵母と菌糸細胞の層を表し、さらにバイオフィルム開発のための前提条件である。C.アルビカンスカテーテル -関連の感染症高い死亡率と関連している。バイオフィルムの一般的な特徴は、そのようなアゾール3,4-として知られている抗真菌剤、に彼らの減少した感受性である。このようなエキノカンジンおよびアンホテリシンBのリポソーム製剤などの抗真菌薬の唯一の新しいクラスは、カテーテル関連感染症5-7に対して活性であることが判明した。そのため抗真菌薬にバイオフィルムの回復力のため、治療的アプローチは、非常に多くの場合、カテーテルの除去およびソールソリューションとして、その後の交換につながる、制限されています。
Cの私たちの現在の理解の大半albicansのバイオフィルムの発達は、上述したデバイス、 すなわち、シリコーン、ポリウレタン2の製造に用い、非生物ポリスチレン等の基板、またはプラスチック上のin vitro研究に由来する。これらのモデルは非常に進んでいるし、可能な限り生体内での状況を模倣しようとする。しかしながら、これらのシステムは、連続的な血流及びtを含まない彼のホスト、免疫系。これは、中心静脈カテーテル（CVC）モデル8-10、口腔カンジダ11の義歯の口内炎モデルおよびカテーテル関連カンジダ12用のマウスモデルとしてのin vivoモデル系の開発をもたらした。さらに、C. albicansのバイオフィルムの開発は、膣13と口腔14からのものとして粘膜表面上の生体内で検討した。私たちの研究室では、皮下C.の設立で貢献Sprague Dawleyラット15の背面に感染したカテーテル片の移植物に基づいているアルビカンスバイオフィルムモデル。このモデルは、成功したフルコナゾールにバイオフィルムの感受性をテストし、薬5,16をエキノカンジン、ジクロフェナク及びカスポファンギン17の組合せ療法の効果を研究するために我々の研究室で使用された。より最近では、我々は、BALB / cマウス18,19で使用するためにこのシステムを適合される。でin vivoモデル他との比較が、この皮下モデルの主な利点は、埋め込 まれたカテーテル片を内腔の内側に開発動物ごとに複数のバイオフィルムを研究する可能性がある。
実験動物の数を減らすために、我々は、Cの開発を研究するためにこのモデルを適応しているアルビカンスバイオフィルム非侵襲的に生物発光イメージング（BLI）18,19を使用します。この方法は、動物の犠牲を回避する、（我々の場合に移植カテーテルの面積）は、関心のある領域における特定のBLIシグナルを測定することによって、バイオフィルムを定量するために用いることができる強力な技術であることが判明した。 C.などにより、特定のluxオペロン20の導入遺伝子および生物発光反応に必要な基質の両方を発現することができる細菌の比較では、ほとんどの真核生物、 アルビカンスは、と結合し、ルシフェラーゼ遺伝子の異種発現に依存している例えば、D-ルシフェリンまたはセレンテラジン21などの特定の基質、の外用投与。おそらく、真菌細胞壁およびCの存在に起因しアルビカンスの形態形成、ルシフェラーゼ酵素の基質の細胞内送達は、主な課題21でした。この問題を解決するために、Enjalbert ら 22は、合成C.株を設計し自然分泌型ガウヨモギルシフェラーゼ遺伝子（GLUC）のアルビカンスコドン最適化バージョンは 、C。に融合させたアルビカンスPGA59遺伝子は、GPI-は、細胞壁アンカータンパク質。なぜなら、細胞壁でのルシフェラーゼの存在、基質の細胞内アベイラビリティに関する問題を回避することができる。この特定のシステムはC.によって引き起こされる表面的な感染症を研究するために使用したアルビカンス 22。ごく最近、BLIは、また、口腔咽頭カンジダ症およびそのpossiblの進行を追跡するために使用された、電子処理23。このような所見は、自由生活細胞だけでなく、デバイス関連感染によって引き起こされる感染症を研究するための有望な技術としてBLIの使用をサポート。
本研究では、Cを記述するBLIを使用したポリウレタンカテーテルBALB / cマウスでピースとその定量化にalbicansのバイオフィルムの開発。私たちは、生きた動物のマウスに移植すると、その後のバイオフィルムの開発に続く接着の期間中にポリウレタンカテーテルのin vitroでの植民地化の詳細なプロトコルを提供する。別にC.によって放出されるBLI信号を測定するからアルビカンス細胞は、我々はまた、バイオフィルムの真菌負荷の定量化のための標準的な手法との比較のためにコロニー形成単位を決定する。
Protocol
Representative Results
Discussion
宿主免疫系は、in vitroモデルで説明することはできないバイオフィルム形成に必須の因子であるので、微生物バイオフィルム専用の研究のための動物モデル、及び特に齧歯類モデルの使用は、非常に重要である。本研究では、比較的簡単な皮下C.を記述簡単に研究室に採用することが可能と強力な技術的なスキルを必要としないアルビカンスバイオフィルムマウスモデル、…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
References
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