قياس مرنا تسوس الأسعار<em> خميرة الخباز</em> استخدام<em> rpb1-1</em> سلالات
Summary
ويتحدد مستوى الدولة المطرد للمن mRNAs محددة من معدل توليف واضمحلال مرنا. معدلات تدهور مرنا على نطاق الجينوم أو معدلات اضمحلال من mRNAs محددة يمكن قياسها من خلال تحديد مرنا نصف العمر. يركز هذا البروتوكول على قياس معدلات تسوس مرنا في خميرة الخباز.
Abstract
مرنا مستويات حالة مستقرة تختلف باختلاف الظروف البيئية. تنظيم مستويات تراكم حالة مستقرة من مرنا يضمن أن المبلغ الصحيح للبروتين يتم تصنيعه لظروف النمو المحددة للخلية. نهج واحد لقياس معدلات تسوس مرنا هو منع النسخ والرصد لاحقا اختفاء مرنا موجودة بالفعل. ويمكن بعد ذلك كميا معدل تسوس مرنا، ودقيقة نصف الحياة ويمكن تحديد ذلك باستخدام عدة تقنيات. في S. الخباز والبروتوكولات التي تقيس مرنا وقد وضعت نصف العمر وتشمل تثبيط النسخ من مرنا باستخدام سلالات التي تؤوي أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II، rpb1-1. تقنيات أخرى لقياس مرنا نصف حياة تشمل عرقلة النسخ مع مثبطات النسخي مثل thiolutin أو 1،10-phenanthroline، أو بدلا من ذلك، من خلال الاستفادة من mRNAs التي هي تحت سيطرة أحد المروجين regulatableمثل الجلاكتوز المروج محرض وخارج TET النظام. هنا، نحن تصف قياس S. معدلات تسوس الخباز مرنا باستخدام أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II. هذه التقنية يمكن استخدامها لقياس مرنا معدلات اضمحلال من mRNAs الفردية أو على مستوى الجينوم.
Introduction
النسخ واضمحلال مرنا محددة من المحددات الحاسمة في التعبير الجيني. معدل التوليف واضمحلال من mRNAs محددة يحدد مستوى ثابت للدولة من أن مرنا معين. مستويات الحالة المستقرة للمن mRNAs تحكم وفرة من mRNAs وتحديد مقدار كل مرنا هو متاح لتخليق البروتين. وتستخدم قياسات مرنا نصف العمر على نطاق واسع لتحديد معدل اضمحلال من mRNAs. من mRNAs تسوس محددة بمعدلات مختلفة التي ترتبط ملامح مرنا، وظيفة البروتين المشفرة بواسطة مرنا والظروف البيئية. اعتمادا على تقنية تستخدم لتحديد معدلات تسوس مرنا، ويمكن تحديد قياسات معدل التحلل إما على الصعيد العالمي أو النصوص الفردية. في خميرة S. الخباز، والتقنيات التي تستخدم عادة لقياس معدلات تسوس مرنا العالمي وتشمل الاستفادة من سلالة الخميرة إيواء أليل حساس درجة حرارة RNA بوليميريز الثاني وtransc الكيميائيمثبطات riptional مثل thiolutin و-1،10 phenanthroline 1-5. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الأساليب لقياس معدلات تسوس مرنا الفردية 4. يمكن أيضا أن تستخدم طرق أخرى لقياس معدلات تسوس مرنا. وتشمل هذه الأساليب نهج لوضع العلامات الدولة ثابت أو استخدام جزيئات الرنا التي يتم التعبير عنها من المروج المنظم الذي يتم التعبير فقط في ظروف محددة. كل من هذه التقنيات لديها مزايا وقيود معينة. تقنية الموضحة هنا تستخدم أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II. وتستخدم هذه الطريقة S. الخباز كنموذج، ولكن يمكن أن يتم تعديلها واستخدامها في أنظمة أخرى باستخدام تقنيات تثبيط النسخي محددة 6.
مرنا القياسات نصف الحياة باستخدام أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II وتستخدم على نطاق واسع لكلا القياسات الجينوم على نطاق والفردية من مرنا تسوس 4-5. تتطلب هذه التقنية استخدام specifجيم سلالة الخميرة التي تؤوي أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II، rpb1-1 1. الأساس المنطقي لهذه التقنية هو أن التعرض لدرجة الحرارة حساسة سلالة الخميرة لدرجة حرارة nonpermissive يثبط تخليق مرنا. وفي وقت لاحق، ويتم رصد اضمحلال مرنا قبل الإيجاد في نقاط زمنية مختلفة بعد أن تم مستعمل النسخ. ويتم رصد اختفاء مرنا قبل الإيجاد عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي من خلايا الخميرة في نقاط زمنية مختلفة بعد أن تحولت النسخ قبالة. ومحددة سلفا النقاط الوقت الذي يتم حصاد الخلايا الخميرة التي كتبها تجربة رائدة، وتعتمد على النصوص ونظام يجري التحقيق فيها. وتستخدم نقاط زمنية أسرع للنصوص قصيرة الأجل، في حين يتم استخدام نقاط زمنية أطول لالنصوص تعد عاش. بعد ذلك، يتم رصد اضمحلال مرنا إما عن طريق تحليل لطخة الشمالي، PCR الكمي أو RNAseq.
قياس مرنا نصف العمر باستخدام الشركة المصرية للاتصالاتmperature أليل حساسة من RNA البلمرة II مزاياه. أولا، هذه التقنية سهلة ومباشرة إلى الأمام. ثانيا، بمجرد الحصول على سلالة الخميرة أو إنشاء في المختبر يمكن تحديد مرنا القياسات نصف الحياة في ظروف النمو المختلفة. تمكين تحديد التأثير البيئي على تسوس مرنا. ثالثا، يمكن رصد معدلات تسوس مرنا على نطاق الجينوم. استخدام تقنيات النسخ تثبيط الأخرى لديها أيضا مزايا وقيود. على سبيل المثال، استخدام المروج محرض يتطلب استنساخ فرعي لتوليد مرنا التي هي تحت سيطرة المروج المنظم. Thiolutin غير متوفرة بسهولة وغير مكلفة عندما تكون متاحة. وبالإضافة إلى ذلك، ليست مفهومة وضع thiolutin للعمل تماما وتم الإبلاغ عن أن تؤثر على العمليات الخلوية الأخرى بما في ذلك منع تسوس مرنا 7. بدلا من ذلك، 1،10-phenanthroline، هو أكثر متاحة بسهولة. وعلاوة على ذلك، فإن جميع التقنيات المستخدمة لمنع النسخ يمكن بيرتURB ظيفة الخلوية ويمكن أن تؤثر على المختلف في mRNA في طرق مختلفة. يحتاج محقق لتحديد أنسب طريقة لاستخدام في ظروف تجريبية لتحقيق النتائج الأكثر موثوقية. لتحديد الطريقة التي هي الأكثر ملاءمة لتطبيقها، يحتاج الباحث إلى التعرف على النصوص وظيفة من البروتينات المشفرة بواسطة النصوص التي يجري التحقيق فيها. القياسات معدل تسوس مرنا الأكثر موثوقية هي تلك التي يتم تحديدها باستخدام تقنيات متعددة وتظهر معدل تسوس نفسه. لا تقنية واحدة هي دائما أفضل، والأسلوب الأكثر ملائمة يعتمد على حالة معينة.
العديد من الدراسات في S. الخباز وقياس معدلات تسوس مرنا في مختلف الظروف والخلفيات الوراثية. الظروف أن معدلات تسوس مرنا تقاس في تعتمد على التجربة المحددة التي يجري التحقيق فيها. قياس معدلات تسوس مرنا في بيئات الخلوية المختلفة يحدد ما إذا كان يجري الشروطدرست تؤثر بشكل تفضيلي معدلات اضمحلال من mRNAs محددة. معدلات اضمحلال من mRNAs يمكن أيضا أن تختلف تبعا لسلالة الخميرة المستخدمة. على سبيل المثال، يمكن تحديد معدلات تسوس مرنا في البرية من نوع خلايا الخميرة وخلايا الخميرة مع ظيفي بوساطة هراء تدهور مرنا (NMD) المسار. تم العثور على هذا التدهور مسار مرنا في جميع الكائنات الحية حقيقية النواة التي تم فحصها حتى الآن وأنه يتسبب في تدهور من mRNAs أن إنهاء قبل الأوان الترجمة 8. وقد تم تحديد NMD البداية كمسار التي تحط من mRNAs مع كودونات إنهاء المبكرة أو كودونات هراء، ولكن ومن المسلم به الآن كمسار الذي ينظم أيضا التعبير عن عدم هراء التي تحتوي على أنواع من mRNAs الطبيعية. وتدهورت من mRNAs التي هي أهداف للمسار السريع في خلايا الخميرة مع مسار وظيفي NMD واستقرت في خلايا الخميرة مع مسار NMD غير وظيفي. وهكذا، فإن حياة نصف من من mRNAs التي أهدافا مباشرة من هذا المسار هي أقصر في البرية من نوع الخميرة سلليرة سورية مقارنة مع خلايا الخميرة مع مسار NMD غير وظيفي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تثبيط تخليق مرنا ومراقبة دوران مرنا في غياب توليفة جديدة هو الأسلوب الذي كثيرا ما يستخدم لقياس معدلات تسوس مرنا. في S. الخباز، وقياس معدلات تسوس مرنا عن طريق تثبيط النسخ باستخدام أليل حساس درجة حرارة RNA بوليميريز الثاني هو واحد من أكثر الوسائل استخداما. هذه الطري?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
Riferimenti
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
