Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

Summary

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Abstract

De omzetting van licht in elektrische impulsen optreedt in de buitenste retina en is grotendeels bereikt door staafjes en kegeltjes fotoreceptoren en retinale pigmentepitheel (RPE) cellen. RPE bieden kritische steun voor de fotoreceptoren en de dood of disfunctioneren van RPE cellen is kenmerkend voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de voornaamste oorzaak van permanent verlies van het gezichtsvermogen bij mensen van 55 jaar en ouder. Hoewel er geen remedie voor AMD is geïdentificeerd, kan implantatie van gezonde RPE in zieke ogen blijken een effectieve behandeling, en grote aantallen RPE cellen kunnen gemakkelijk worden gegenereerd uit pluripotente stamcellen. Verschillende interessante vragen over de veiligheid en werkzaamheid van RPE cellen levering kan nog worden onderzocht in diermodellen en goed aanvaarde protocollen gebruikt injecteren RPE ontwikkeld. De hier beschreven techniek is door meerdere groepen in diverse studies en omvat eerst een gat in het oog met een scherpe naald. Dan is een spuit met een blunt naald geladen met cellen wordt ingebracht door het gat en door het glasvocht, totdat deze net tegen de RPE. Met deze injectiemethode, die relatief eenvoudig en vereist minimale apparatuur, we consistente en efficiënte integratie van stamcellen afgeleide RPE cellen bereiken tussen de ontvangst RPE die aanzienlijke hoeveelheid fotoreceptor degeneratie voorkomt in dierlijke modellen. Hoewel geen onderdeel van de eigenlijke protocol, ook beschrijven hoe de omvang van het trauma veroorzaakt door de injectie en Controleren of de cellen werden geïnjecteerd in de subretinale ruimte met in vivo beeldvormende modaliteiten. Tenslotte wordt het gebruik van dit protocol niet beperkt tot RPE cellen; kan worden gebruikt om een ​​verbinding of cel in de subretinale ruimte te injecteren.

Introduction

The sensory retina is organized in functional tiers of neurons, glia, and endothelial cells. Photoreceptors at the back of the retina are activated by light; through phototransduction they convert photons into electrical signals that are refined by interneurons and transmitted to the visual cortex in the brain. Phototransduction cannot occur without the coordinated efforts of Mueller glia and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE are organized in a monolayer directly behind the photoreceptors and perform multiple and diverse functions integral to photoreceptor function and homeostasis. In fact, RPE and photoreceptors are so co-dependent that they are considered to be one functional unit. Death or dysfunction of RPE results in devastating secondary effects on photoreceptors and is associated with age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of blindness in the elderly^1,2.

While no cure has been discovered for AMD, several clinical studies have shown that RPE cell replacement may be a promising therapeutic option^3-13. With the advent of stem cell technology, it is now possible to generate large numbers of RPE cells in vitro from embryonic and induced pluripotent stem cells (hES and hiPS) that strongly resemble their somatic counterparts functionally and anatomically^14-26. Stem cell-derived RPE have also been shown to function in vivo by multiple independent groups, including our own, to significantly slow retinal degeneration in rat and mouse lines with spontaneous retinal degeneration^{16,18,21,22,25,28,29}. This combination of clinical and preclinical supporting evidence is so compelling that several clinical trials to prevent retinal degeneration using stem cell-derived RPE cells are now ongoing^30,31.

RPE can be readily derived from hES and/or hiPS and implanted in the subretinal space of rodents using various derivation and injection techniques^32,33. (See Westenskow et al. for a methods paper in multimedia format demonstrating the directed differentiation protocol we employ)³⁴. There are critical remaining questions regarding the safety, survival, and functional capacity of exogenously delivered RPE cells upon implantation, therefore the ability to perform subretinal injections in rodents is a critical skill^{16,18,21,29,36,37}. The delivery of RPE is not trivial, and the field is divided on the most effective injection technique. The protocol we describe here is a simple and effective way to deliver of bolus of RPE cells subretinally, and was used in the first clinical trial for stem cell-derived RPE transplantation³¹. (The reader may also refer to another JoVE article by Eberle et al. for an alternative depiction of subretinal injections in rodents.³⁸)

The technique outlined in this manuscript cannot be visualized and trauma is unavoidable (as with any subretinal injection technique). It is performed by making a hole just under the limbus vessels and inserting a blunt needle along a transscleral route to inject a bolus of cells under the diametrically opposed retina. The person doing the injection will feel resistance as the blunt needle touches the retina. The cells may be directly visualized after the injection, however, and the degree of the induced retinal detachment can be determined by labeling the RPE cells with a transient fluorescent marker and detecting them with a confocal scanning ophthalmoscope (cSLO). An optical coherence tomography (OCT) system can also be used to monitor the trauma and easily identify the injection site.

Protocol

Opmerking: Alle dieren werden volgens de ethische richtlijnen die door de Scripps Research Institute behandeld. 1. Voorbereiding van Materialen voor de Injectie (~ 20 min) Voorverwarmen cel dissociatie oplossing (bij voorkeur een die wordt geïnactiveerd door verdunning niet met serum), steriel PBS, en kweekmedia (Tabel 1). Steriliseren van de spuit met een stompe naald door het demonteren en het koken van de onderdelen in wate…

Representative Results

We kunnen een opschorting van RPE cellen te leveren in de subretinale ruimte van knaagdieren snel en consistent gebruik van de in dit manuscript beschreven techniek. Terwijl het niet nodig is, kan trauma's sterk worden geminimaliseerd via het getoond met een micromanipulator in figuur 1A & B-setup. Houd het knaagdier zoals getoond in figuur 1C tijdelijke proptosis. De stappen zijn hetzelfde als uitgevoerd met de micromanipulator of met de hand; deze worden afgebeeld in de cartoo…

Discussion

In dit artikel beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige werkwijze voor het uitvoeren subretinale injecties van RPE cellen in suspensie bij ratten en muizen. Het protocol is eenvoudig te leren en ervaring met de techniek zal vertalen in minder trauma (figuur 3; dit is een van de betere injecties), vooral een micromanipulator wordt gebruikt (figuur 1A). Elk trauma kan worden gevolgd in vivo met een cSLO en oktober (zie figuur 2), indien beschikbaar. Als afbeeld…

Materials

Name of Material/ Equipment (A-Z)	Company	Catalog Number	Comments/Description
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 mL x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 ug x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 mL x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 mL x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 gauge, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 mL x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 mL x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 mL x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 mL x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	100 mL x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 mL)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 gauge, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 mL x 1