Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).
Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein’s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.
蛋白相互作用网络(PIN码)提供的蛋白质如何在功能上组织在小区1低分辨率图谱 。两种蛋白质之间的每个物理连接,或蛋白质 – 蛋白质相互作用(PPI),可以表示的关联是稳定的时间,例如那些蛋白质复合物中发现的,并有助于该单元的结构组织。这些连接也可能代表调节的活性,稳定性,本地化和两个合作伙伴的交互瞬态协会。识别一个给定的蛋白质的物理相互作用配偶因此提供了关于该蛋白质2,3的功能和调节的丰富信息。由于这些原因,大量的努力已投入朝向在模式生物,包括大肠杆菌 4-6, 拟南芥7,酿酒酵母8-12,果蝇<PIN码的映射/ EM> 13,秀丽隐杆线虫 14和智人 15。这些研究提供了重要的见解蛋白质是如何组织与以前未知的功能蛋白的细胞,因此关键信息。
几个战略已经发展了很多年学习的PIN。这些技术可大致分为基于他们提供关于质子泵抑制剂的种类信息(在16-18综述)三类。第一种是基于酵母双杂交及其衍生物19。这些技术提供对蛋白质之间的直接关联,允许建设的二进制网络的信息。第二系列基于诱饵蛋白的亲和纯化和它们相关的伙伴,例如亲和纯化,随后通过质谱法20的识别。这些方法鉴定的蛋白质可直接组或间接相关的,通常以稳定的方式,而且是十分强大,以确定蛋白质复合物。第三种方法是基于蛋白质片段互补测定(PCA的)11,21。这种方法提供了两个前方法之间的分辨率的中间水平,因为它允许检测蛋白质之间的直接和近端关联。每一种技术都有自己的长处和短处,最近检讨18。
最好所述的真核细胞的PIN是由芽殖酵母酿酒酵母的远的1,部分原因是它的蛋白质组相对比其它模型真核生物和由于高通量测定法不太复杂的,以检测质子泵抑制剂已先被检测,并且更有效地在这种模式生物9-12实施。一种特别有效的方法为酵母体系是二氢叶酸还原酶蛋白质片段互补测定(DHFR-PCA),即一直一个测定用在不同的上下文来研究标准和扰动条件11,22-26酵母PIN。此方法依赖于一个存活测定法,使直接和近直接质子泵抑制剂的检测为在两个内源表达水平与所述相互作用配偶11,21以定量方式27本机的亚细胞定位的给定诱饵蛋白。使用这种测定法(上高密度集落阵列即菌落大小)中获得的信号从而反映了诱饵和猎物在蜂窝环境中,几乎等同于野生型细胞中的一个之间形成的蛋白质复合物的量。该测定法是基于参与叶酸代谢记者酶的重构,二氢叶酸还原酶(DHFR),由此DHFR的被融合到两种蛋白的兴趣两个互补片段使得接近时的两个蛋白相互作用,这又导致了酶的活性1的可逆重构1和生长的菌株在含培养基甲氨蝶呤(MTX; 图1)。此化合物抑制内源性DHFR酶,但不是突变1在测定28使用。两个集合的PCA菌株,一种含〜4300 的MATa菌株与ORF融合到DHFR F [1,2]片段和一种含〜4800 MATα菌株与ORF融合到DHFR [3]片段,可以购买到实施DHFR-PCA在或大或小规模的在任何实验室。在这里,我们描述了一种普遍但详细的协议,以屏幕为1诱饵蛋白,并使用该测定〜4800猎物蛋白质之间质子泵抑制剂。
我们描述的基础上DHFR-PCA法使物理干扰作用的系统识别,在高通量任何诱饵蛋白的协议。这个协议可以通过筛选更多诱饵适于,这在复制中的任何期望的水平。我们证明该协议的可靠性物理相互作用伙伴的标识所涉及的核孔复合诱饵蛋白:Nup82。我们的分析使能找到5以前报道交互件和一个先前未报告的交互件( 图3F和3G),突出的方法来研究的酵母蛋白质相互作用组的能力。
这里所描述的协议包括几个关键步骤,以使实验者更应注意。我们建议:1)确保诱饵DHFR F [1,2]的融合是正确的( 图1B);这可以通过测序的结构和测量电来实现荷兰国际集团使用抗DHFR F [1,2]或抗DHFR F [3]抗体正确蛋白表达; 2)在此之前开始屏幕,建议以验证是否任何感兴趣的诱饵显示在屏幕的PCA混杂相互作用。这可通过用毒饵越过与合适的L-胸苷控制或通过手动配合与适当的L-胸苷控制诱饵和执行在介质MTX一个生长测定进行控制的屏幕来完成。 3)将板应在每天浇之前它们被用来使水分是最适合于在印刷过程中的琼脂表面细胞粘附; 4)源板不应该使用多于4倍,以在目标板传送足够的细胞。增大目标板的拷贝数可以通过连续步骤膨胀( – > 16份- > 64份如 4份)来完成。此外,细胞可以在草坪上或在不同的回合复制之间的群体不同位置被拾起; 5)如果几个Positions丢失二倍体选择(S),确保在源板未在配合工序中使用过许多次之后(步骤4.5至4.7); 6)确保MTX中包含了正确的浓度的所有基本要素。的确,如果在所有不生长的MTX培养基上观察到,它可以是,因为没有相互作用是可检测由PCA针对感兴趣的蛋白质或因为MTX介质未正确制备。以确保该介质允许菌株表示DHFR片段互补的生长,组成型相互作用可以在收集的空位置被加入,并用作阳性对照诸如DHFR片段融合至亮氨酸拉链结构部分33( 图1C)。使用链接器DHFR片段或拉链连接-DHFR片段并行测试将允许,这往往使假阳性相互作用的条件,让所有的细胞生长(低浓度MTX或诱饵蛋白区分为DESCRIBED以下),防止所有菌株的生长(MTX浓度过高或必要成分丢失在培养基中)的条件; 7)由于PCA是通过连续多轮次重复的从一个介质执行到另一个,如果,例如,所述销工具没有被正确复制轮和/或最后的水之间消毒,可能会出现不同的板之间的菌株间的交叉污染浴( 即湿站)消毒过程中由以前的复制轮殖民地污染。上的阵列的几个位置是空的,因此可以用来作为对照位置处没有生长应观察到检测交叉污染。
图像分析可以使用多种软件公布(见协议第5条),或任何自定义脚本来执行。在这项研究中,自定义脚本执行以下步骤:1)的脚本中减去空盘,以便共同像素各自板的值的像素值rrect照明偏见。 2)该脚本将每个背景修正图像使用10 3的像素值阈值),对于每一个1536位的各板块,通过覆盖上的优势菌落矩形确定为二进制,脚本运行ImageJ的“分析颗粒… “功能在一个圆形的选择。圆状的选择被设置具有半径等于两个位置减去10个像素之间的间隔。 4)脚本选择从选择的中心最近的粒子,并确认它作为一个群体,如果它的位置是不超过半两菌落之间的间隔距离的选择的中心。 5)脚本测量的背景校正的图像所选择的粒子的像素值。 6)为了进一步校正任何剩余的背景照明的偏见,该脚本中减去从圆状的选择所有象素所没有的一个微粒的群体的像素值的部分的平均值。这些校正后的像素值的总和S,存储在附加表1的列“IntDenBackSub”,被用作集落大小的量度。
在分析部分中的一个关键步骤是的意义的阈值的选择。这里,我们选择一个阈值的基础上的负的L-胸苷F [3]的控制的分布,但根据不同的画面的目标,这样的阈值可以是过于严格。实际上,L-DHFR F [3]对照过表达(强TEF启动子),使得所述互补片段可以自发地相互补充,这些都是因此不能代表大多数蛋白质的表达。这是由以下事实的L DHFR F表示分布[3]对照比背景生长(图3D)的平均水平突出。因此,一些具有相互作用分值低于此严格阈值,但是显然的背景生长分布的外侧可被视为推定命中可以表示,例如,瞬时或弱除动作。这些可以进一步被研究和交叉验证,如果,例如,两种蛋白质不表达的水平,可以使DHFR片段似L形的DHFR控制的自发互补。作为替代方案,人们可以以最大限度真阳性超过误报的比例基础上设定的重叠与像BioGRID 35数据库报告的物理交互件的比例的显着性阈值。然而,与使用了L-DHFR分布,这种替代可能不总是可行的话,例如,公知的物理交互件的数量是不够高。此外,该阈值的意义的选择对的假阳性和假阴性的最后数据组的比例的影响。事实上,像任何其他的PPI检测分析,误报可导致从与DHFR融合蛋白的蛋白质的非特异性相互作用,如果,例如,该蛋白质是高度丰富如前面提到的。此由以下事实,一些猎物系统与所有诱饵蛋白质相互作用中的PCA屏幕和,从而例举,需要从分析11( 例如 Tef2和Ade17和补充表2)除去。为了解决这个问题,这两个集合针对相应的L-胸苷控制的控制屏幕的PCA(F [1,2]或F [3]),以确定诱饵和猎物呈现自发的DHFR片段互补可以在特定的条件下进行每个屏幕。此外,在执行一个基因本体论的富集分析可以增加信心数据如果一个给定的诱饵的功能是已知的。另一方面,DHFR-PCA可以产生假阴性有以下几个原因:1)不是所有的蛋白可以融合到DHFR片段,因为这些可能破坏该蛋白质或如果修改他们的定位,例如,在DHFR融合到C-末端干扰定位信号; 2)DHFR重组在某些细胞车厢米AY不会产生叶酸如果,例如,对于叶酸合成的重要前体是不可用; 3)C末端需要是8个纳米的距离内进行的DHFR互补发生11。因此,公知的相互作用可能无法检测到,如果他们的C端没有足够接近空间。这是通过该报告在数据库中,其中大部分是间接Nup82物理相互作用的大部分,并没有在我们的测定法检测到的事实,在这里举例说明。类似地,对于其中C-末端是在反相对于膜的膜蛋白之间的相互作用不会导致DHFR片段互补,不会被检测到11。局限性1)和3)可通过熔合DHFR片段的N-末端的蛋白质的相对简单地规避。这样做可能防止干扰附近的C-末端定位信号,并且可以允许以检测膜蛋白,其N和C末端之间的相互作用是在顺式相对到膜上。
一些挑战仍然PIN码的研究(在2,3审查)。到目前为止产生的引脚映射已经基本上在一个单一的实验条件下每个物种被描述,从而提供了如何蛋白质网络可能会被安排一个快照。因此,有必要对其它实验条件的探索,看看如何销可响应于环境的变化,具体的刺激,在开发或下列突变重组。这些挑战将由用于询问质子泵抑制剂在实时,在活细胞中的新技术的发展和通过适应当前的技术,使它们可用于通过实验室的一个更大的社区来克服。作为定量的技术,可以检测出在DHFR互补的量变化络合物27,DHFR-PCA可适于克服这些挑战,并已经被用于研究如何质子泵抑制剂受DNA损伤剂22 </sup>化学制剂25,基因缺失或23,26在其他酵母品种及其杂交种33。探索这些新尺寸将变得越来越重要,以揭示PIN的动态。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了健康研究加拿大学院(CIHR)授予191597,299432和324265,支持的自然科学和加拿大发现金工程研究理事会和人类前沿科学计划赠款CRL。 CRL是一种新CIHR调查。纪尧姆迪斯由PROTEO奖学金支持。塞缪尔·罗切特是由NSERC和FRQNT奖学金支持。
Name of Material/Equipement | Company | Catalog Number | Comments/Description |
BioMatrix Robot, Bench-top Configuration | S&P Robotics Inc. | BM5-BC | |
96-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-96-10 | Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins |
384-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-384-10 | Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins |
1536-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-1536-05 | Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins |
Automated imaging module | S&P Robotics Inc. | IMG-02 | |
Methotrexate | Bioshop Canada Inc. | MTX440 | CAUTION: toxic compound |
Hygromycin B | Bioshop Canada Inc. | HYG003 | |
Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5010000 | |
Yeast-Interactome Collection | Thermo Scientific | YSC5849 | |
Omni Tray w/lid sterile | Thermo Scientific | 242811 | |
Anti-DHFR F[1,2] antibody | Sigma-Aldrich | D1067 | |
Anti-DHFR F[3] antibody | Sigma-Aldrich | D0942 |