Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).
Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein’s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.
Protein-interaktion netværk (PIN-koder) tilbyder en lav opløsning kort over, hvordan proteiner funktionelt organiseret i cellen 1. Hver fysisk forbindelse mellem to proteiner eller protein-protein-interaktion (PPI), kan udgøre en forening, der er stabil i tid, såsom dem, der findes inden for protein-komplekser, og at bidrage til den strukturelle organisation af cellen. Disse forbindelser kan også repræsentere forbigående foreninger, der regulerer den pågældende aktivitet, stabilitet, lokalisering og interaktioner mellem de to partnere. Identifikation af fysisk interaktion partnere i et givet protein giver derfor rig information om funktion og regulering af dette protein 2,3. Af disse grunde har store indsats sat mod kortlægning af pinkoder i model organismer, herunder Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, Drosophila melanogaster </ Em> 13 Caenorhabditis elegans 14 og Homo sapiens 15. Disse undersøgelser har givet vigtig indsigt i, hvordan proteiner er organiseret i cellen og dermed centrale oplysninger om proteiner med hidtil ukendte funktioner.
Adskillige strategier er blevet udviklet gennem årene til at studere PIN-koder. Disse teknologier kan groft inddeles i tre kategorier baseret på den form for oplysninger, de giver om PPI (revideret i 16-18). Den første er baseret på gær-to-hybrid og dets derivater 19. Disse teknologier giver oplysninger om den direkte forbindelse mellem par af proteiner, som gør det muligt at konstruere binære netværk. Den anden familie er baseret på affinitetsoprensning af agn proteiner og identifikation af deres tilknyttede partnere, såsom affinitetsrensning efterfulgt af massespektrometri 20. Disse tilgange identificere grupper af proteiner, der er direkteeller indirekte er forbundet, generelt på en stabil måde, og er ekstremt stærke til at identificere protein-komplekser. Den tredje tilgang er baseret på protein-fragment komplementeringsgrupper assays (PSA) 11,21. Denne fremgangsmåde giver en mellemliggende niveau af opløsning mellem de to tidligere strategier, da det giver mulighed at opdage direkte og proksimale associationer mellem proteiner. Hver teknik har sine egne styrker og svagheder, som for nylig revideret 18.
Den bedste beskrevne eukaryote PIN er langt den ene af den knopskydende gær Saccharomyces cerevisiae, delvis fordi dens proteom er relativt mindre kompleks end de andre model eukaryoter og fordi high-throughput assays til påvisning af PPI først er blevet analyseret og er mere effektivt implementeret i denne model organisme 9-12. En særlig effektiv metode til gær system er dihydrofolatreduktase-protein-fragment-komplementationsassay (DHFR-PCA), et assay, der har væretbruges i forskellige sammenhænge at studere gær PIN i standard og forstyrret forhold 11,22-26. Denne metode er baseret på en overlevelse assay, der muliggør påvisning af direkte og nær-direkte PPI for en given agn protein ved både endogene ekspressionsniveauer og native subcellulære lokaliseringer af interaktion partnere 11,21 på en kvantitativ måde 27. Signalet opnået under anvendelse af dette assay (dvs. koloni størrelse på high-density koloni arrays) afspejler således mængden af protein komplekser dannet mellem agn og byttedyr i et cellulært miljø næsten svarer til en af vildtypeceller. Assayet er baseret på rekonstitution af en reporter enzym involveret i folatmetabolismen, dihydrofolatreduktase (DHFR), hvorved to komplementære fragmenter af DHFR, som er fusioneret til de to proteiner af interesse bringes i nærhed, når de to proteiner interagerer, som igen fører til den reversible rekonstituering af enzymaktivitet 11 og væksten af stammen på et medium indeholdende methotrexat (MTX; figur 1). Denne forbindelse inhiberer den endogene DHFR-enzym, men ikke det muterede der anvendes i assayet 28. To samlinger af PCA-stammer, hvoraf det ene indeholder ~ 4.300 MATa stammer med en ORF fusioneret til DHFR F [1,2] fragment og en med ~ 4.800 MAT α stammer med en ORF fusioneret til DHFR [3] fragment, kan købes til implementere DHFR-PCA på små eller stor skala i alle laboratorier. Her beskriver vi en generel, men detaljeret protokol til screening for PPI mellem en agn protein og ~ 4.800 prey-proteiner ved hjælp af denne analyse.
Vi beskriver en protokol baseret på DHFR-PCA assay muliggør systematisk identifikation af fysiske interaktionskandidater for en given agn protein ved high-throughput. Denne protokol kan tilpasses ved screening for flere lokkemidler, og dette på ethvert ønsket niveau af replikation. Vi viser pålideligheden af denne protokol ved identifikationen af fysisk interaktion partnere for en agn protein involveret i kerneporen Complex: Nup82. Vores analyse aktiveret for at finde fem tidligere rapporterede interaktionskandidater og en tidligere urapporteret interactor (figur 3F & 3G), fremhæver metodens evne til at studere gærproteinet interactome.
Den her beskrevne protokol omfatter flere kritiske trin, som forsøgslederen bør være opmærksomme. Vi anbefaler, at 1) Sørg for, at agn DHFR F [1,2] fusion er korrekt (figur 1B); dette kan opnås ved sekventering af konstruktion og measuring korrekt proteinekspression under anvendelse af et anti-DHFR F [1,2] eller anti-DHFR F [3] antistof; 2) Før påbegyndelse af skærmen, anbefales det at kontrollere, om nogen agn af interesse udviser promiskuøse interaktioner i PCA skærme. Dette kan gøres ved at udføre kontrol skærme med lokkemad krydset med passende L-DHFR kontrol eller manuelt parre lokkemaden med det passende L-DHFR kontrol og udførelse af en vækst-assay i MTX-medium. 3) Plader skal hældes dagen før de anvendes, så fugt er optimal for celle vedhæftning på agaroverfladen under trykning; 4) Kilde plader bør ikke anvendes mere end fire gange at overføre nok celler på destinationen pladen. Forøgelse af antallet af kopier af destination plade kan gøres ved successive trin for ekspansion (f.eks 4 eksemplarer -> 16 kopier -> 64 kopier). Alternativt kan cellerne blive hentet på forskellige positioner på græsplæner eller i kolonien mellem forskellige runder af replikation; 5) Hvis flere positions mangler efter diploide (e) valg, skal du sørge for, at kilden pladerne ikke blev brugt for mange gange i parring trin (trin 4,5-4,7); 6) Sørg for, at MTX mediet indeholder alle væsentlige ingredienser på de rette koncentrationer. Faktisk, hvis ingen vækst overhovedet er observeret på MTX medium, kan det være enten fordi ingen interaktion er detekterbar ved PCA for proteinerne af interesse, eller fordi MTX mediet blev ikke fremstillet korrekt. For at sikre at mediet tillader vækst af stammer viser DHFR fragmenter komplementering, kan en konstitutiv interaktion tilsættes på tomme positioner af indsamling og anvendt som en positiv kontrol, såsom DHFR-fragmenter fusioneret til leucin-zipper dele 33 (figur 1c). Parallelle der benyttes de linker-DHFR fragmenter eller lynlås-linker-DHFR fragmenter vil gøre det muligt at skelne mellem forhold, der tillader alle celler til at vokse (lav MTX koncentration eller agn protein, der har tendens til at gøre falsk positive interaktioner, som descrIBED nedenfor), og som forhindrer vækst af alle stammer (MTX-koncentration for høj eller hovedbestanddel mangler i medium); 7) Da PCA udføres gennem successive runder af gentagelser fra et medium til et andet, kan krydskontaminering blandt stammer mellem forskellige plader opstå, hvis, for eksempel, er pin-værktøjet ikke steriliseret korrekt mellem replikation runder og / eller den sidste vand bad (dvs. våd station) i sterilisering procedure er forurenet med kolonier af tidligere replikation runder. Flere holdninger til de arrays er tomme, og kan således anvendes som kontrol positioner, hvor ingen vækst bør overholdes for at opdage krydskontaminationer.
Billedanalyse kan udføres ved hjælp af flere publicerede software (se afsnit 5 i protokollen) eller enhver brugerdefineret script. I denne undersøgelse, den brugerdefinerede script udfører de følgende trin: 1) script subtraherer pixelværdier af en tom plade pixelværdier for hver plade med henblik på at samarbejderrect til belysning bias. 2) Scriptet konverterer hver baggrund korrigeret billede til binær hjælp af en pixel værdi tærskel på 10. 3) For hver 1.536 positioner hver plade, bestemt ved overlejring et rektangel på kanten kolonier, scriptet kører ImageJ "Analyze partikler … "-funktionen i en cirkulær markering. Den cirkulære udvælgelse indstilles med en radius svarende til intervallet mellem to positioner minus 10 pixels. 4) script vælger den nærmeste partikel fra centrum af udvælgelse og bekræfter det som en koloni, hvis dens placering ikke er mere end halvdelen af intervallet mellem to kolonier væk fra centrum af markeringen. 5) script måler pixelværdier for den valgte partikel på baggrund korrigeret billede. 6) For yderligere at rette eventuelle tilbageværende baggrundsbelysning bias, scriptet subtraherer middelværdien af alle pixels fra cirkulær markering, der ikke var en del af en partikel til pixelværdier i kolonien. Summen af disse korrigerede pixelværdis, der er lagret i kolonnen "IntDenBackSub" af supplerende tabel 1, anvendes som et mål for koloni størrelse.
Et kritisk trin i analysen del er valget af tærskelværdien betydning. Her valgte vi en tærskel baseret på fordelingen af den negative L-DHFR F [3] kontrol, men afhængigt af formålet med skærmen, kan en sådan tærskel være for strenge. Faktisk L-DHFR F [3] kontrol overudtrykkes (stærk TEF-promotor), således at komplementære fragmenter spontant kan supplere hinanden, og disse er derfor ikke repræsentative for ekspressionen af de fleste proteiner. Dette understreges af den omstændighed, at fordelingen af L-DHFR F [3] kontrol er højere end gennemsnittet af væksten baggrund (figur 3D). Således nogle interaktioner med score under denne streng grænse, men der er helt klart uden for distributionen vækst baggrund kan betragtes som formodede hits, der kan repræsentere, for eksempel, forbigående eller svag interaktioner. Disse kan undersøges yderligere og krydsvalideret hvis, for eksempel, er de to proteiner ikke udtrykkes på niveauer, der kan tillade spontan komplementering af DHFR fragmenter ligesom L-DHFR kontroller. Som et alternativ, kan man sætte en betydning tærskel baseret på andelen af overlapning med rapporterede fysiske interaktionskandidater i databaser som BioGRID 35 for at maksimere andelen af sande positive forhold falske positiver. Men i modsætning til anvendelse af L-DHFR distribution, dette alternativ kan ikke altid være mulig, hvis for eksempel antallet af kendte fysiske interaktionskandidater er ikke tilstrækkelig høj. Desuden er valget af tærsklen betydning har en indvirkning på andelen af falsk positive og falsk negative i den endelige datasæt. Faktisk, som enhver anden PPI påvisningsassay kan falske positiver skyldes uspecifik interaktion af et protein med DHFR-fusionsprotein, hvis for eksempel proteinet er meget rigelige som tidligere nævnt. Detteer eksemplificeret ved det forhold, at nogle byttedyr systematisk interagere med alle bait-proteiner i PCA skærme og dermed skal fjernes fra analysen 11 (f.eks Tef2 og Ade17 tillægs- og tabel 2). For at omgå dette problem, en kontrol PCA skærm af de to samlinger mod passende L-DHFR kontrol (F [1,2] eller F [3]) for at identificere lokkemad og byttedyr udviser spontan DHFR fragmenter komplementering kan udføres i de særlige betingelser af hver skærm. Desuden kan udføre en Gene Ontology berigelse analyse øge tilliden i dataene, hvis funktionen af en given agn er kendt. På den anden side kan DHFR-PCA give anledning til falske negativer af flere grunde: 1) ikke alle proteiner kan fusioneres til DHFR fragmenter, da disse kan destabilisere proteinerne eller ændre deres lokalisering hvis for eksempel DHFR fusion til C-terminus interfererer med en lokalisering signal; 2) DHFR rekonstituering i nogle cellulære rum may ikke producerer folat hvis for eksempel en afgørende forløber for folat syntese er ikke tilgængelig; 3) C-termini behov for at være i en afstand af 8 nm for DHFR komplementering at forekomme 11. Således kan en velkendt interaktion ikke detekteres, hvis deres C-termini ikke er tæt nok i rummet. Dette er eksemplificeret her ved det faktum, at en stor del af Nup82 fysiske interaktioner rapporteret i databaser, hvoraf de fleste er indirekte, ikke blev påvist i vores assay. Tilsvarende vil interaktioner mellem membranproteiner, som C-termini er i trans i forhold til membranen ikke føre til DHFR fragmenter komplementering og vil ikke blive registreret 11. Begrænsninger 1) og 3) kan omgås relativt enkelt ved at fusionere DHFR fragment til N-termini af proteinet. Dette kan forhindre at forstyrre en lokaliseringssignal nær C-terminalerne, og kan gøre det muligt at påvise en interaktion mellem membranproteiner, hvis N- og C-terminalen er i cis relativetil membranen.
Flere udfordringer i studiet af stifter (revideret i 2,3). Kortene af stifter produceret hidtil i vid udstrækning blevet beskrevet i en enkelt eksperimentel betingelse for hver art og dermed tilbyde en enkelt øjebliksbillede af, hvordan protein netværk kan organiseres. Der er derfor behov for udforskning af andre eksperimentelle betingelser for at se, hvordan PIN-koder kan omlægges som reaktion på miljøforandringer, specifikke stimuli, på tværs udvikling eller følgende mutationer. Disse udfordringer vil blive overvundet af udviklingen af nye teknologier spørgekriterierne PPI'er i real-time, i levende celler og ved at tilpasse de nuværende teknikker, så de kan bruges af et større fællesskab af laboratorier. Som en kvantitativ teknik, der kan påvise ændringer i mængden af DHFR komplementering komplekser 27 kan DHFR-PCA tilpasses til at overvinde disse problemer og er blevet anvendt til at undersøge, hvordan PPI påvirkes af et DNA-beskadigende middel 22 </sup>, kemiske stoffer 25, gendeletioner 23,26 eller i andre gær arter og hybrider 33. Udforskning disse nye dimensioner vil blive mere og mere vigtigt at afsløre dynamikken i PIN-koden.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den canadiske Institute of Health Research (CIHR) Grants 191.597, 299.432 og 324.265, en naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada Discovery tilskud og en Human Frontier Science Program tilskud til EF-referencelaboratoriet. CRL er en CIHR Ny Investigator. Guillaume Diss understøttes af en PROTEO fællesskab. Samuel Rochette understøttes af NSERC og FRQNT stipendier.
Name of Material/Equipement | Company | Catalog Number | Comments/Description |
BioMatrix Robot, Bench-top Configuration | S&P Robotics Inc. | BM5-BC | |
96-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-96-10 | Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins |
384-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-384-10 | Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins |
1536-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-1536-05 | Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins |
Automated imaging module | S&P Robotics Inc. | IMG-02 | |
Methotrexate | Bioshop Canada Inc. | MTX440 | CAUTION: toxic compound |
Hygromycin B | Bioshop Canada Inc. | HYG003 | |
Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5010000 | |
Yeast-Interactome Collection | Thermo Scientific | YSC5849 | |
Omni Tray w/lid sterile | Thermo Scientific | 242811 | |
Anti-DHFR F[1,2] antibody | Sigma-Aldrich | D1067 | |
Anti-DHFR F[3] antibody | Sigma-Aldrich | D0942 |