Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico
Summary
This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.
Abstract
The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.
Introduction
I linfociti T sono componenti critici del sistema immunitario adattativo. Le cellule T sono responsabili non solo mediare direttamente risposte immunitarie protettive a patogeni attraverso una varietà di meccanismi effettori, ma anche mantenere attivamente immunologica auto-tolleranza e dirigere le risposte di altre cellule del sistema immunitario. Queste funzioni sono diretti attraverso una serie di segnali integrati, compreso recettore delle cellule T (TCR) legatura, citochine e chemochine, e metaboliti 1. Di questi segnali, il TCR è di particolare importanza, in quanto fornisce la specificità caratteristica che definisce il ruolo delle cellule T nell'immunità adattativa. Un TCR interagisce con antigeni peptidici lineari presentati da MHC (HLA ortologo umano) molecole (complessi pMHC) in modo altamente specifico e sensibile per fornire i segnali che attivano la funzione delle cellule T effettrici. I parametri biochimici delle interazioni TCR con leganti pMHC non solo forniscono la specificità per Tattivazione delle cellule, ma anche avere un impatto qualitativo sulla funzione delle cellule T 2 successiva. Così, studiando la funzione delle cellule T richiede spesso di esaminare le risposte delle cellule T clonali con specificità antigenica definito.
Il vano umano delle cellule T, che contiene circa 10 12 cellule T αβ, contiene, secondo le stime 10 luglio-10 agosto αβTCRs distinte 3-4. Questo vasto repertorio offre opportunità per il riconoscimento della vasta gamma di peptidi da potenziali agenti patogeni tali da richiedere una risposta delle cellule T per l'immunità protettiva. Si stima che la frequenza delle cellule T rispondere ad un dato antigene estraneo presentata dalla auto-MHC è dell'ordine di 10 -4 – 10 -7 in assenza di prima risposta immunitaria a questo antigene 5. L'ingenuo repertorio delle cellule T è modellato dalla selezione timica per garantire la capacità di riconoscere auto-MHC presentano antigeni peptidici e limite reagisconoivity contro antigeni self-peptide, massimizzando l'utilità potenziale di mediare l'immunità protettiva 2. Tuttavia, in violazione del presente progettato reattività relativamente grande frequenza, 10 -3 – 10 -4, di cellule T da individui immunologicamente naive rispondere alla stimolazione con cellule allogeniche, riconoscendo entrambe le molecole MHC estere nonché peptidi endogeni che presentano 6. Il riconoscimento di allogenici ligandi pMHC è strutturalmente simile al riconoscimento di antigeni estranei presentate da auto-MHC; TCR rende interazioni biochimiche critici sia con la molecola MHC allogeniche e il peptide presentato 7. La natura robusta della risposta delle cellule T allogeniche ai risultati della stimolazione della diversità dei pMHC complessi presenti sulla superficie delle cellule allogeniche 8. Si stima che ogni MHC presenta circa 2 x 10 4 differenti antigeni peptidici endogeni 9. Questo breadth di risposta alla stimolazione allogenico è un aspetto significativo della patologia clinicamente rilevanti, come il rigetto o di malattia da trapianto contro ospite (GVHD), derivanti da alloreattività cellule T.
Studio delle cellule T risposte alloreattivi umani ha tradizionalmente invocato l'esame delle risposte policlonali di cellule T naive in seguito alla stimolazione con cellule allogeniche. Stimolazione ripetuta con la stessa linea di cellule allogeniche combinato con diluizione limite analisi è in grado di generare cellule T clonali con riconoscimento definito di allogenico HLA 10. Tuttavia, questo approccio è problematico per l'esame delle risposte ai singoli ligandi allogenici pMHC, come il grande e variegato repertorio di endogena pMHC complessi presenti per un determinato allogenico HLA stimola un ampio repertorio di cellule T. Questa stimolazione popolazione di massa e di limitare la diluizione approccio richiederebbe lo screening di un gran numero di cloni per isolare le cellule T con il riatti desideratovità contro un singolo ligando pMHC. Inoltre, la frequenza delle cellule T che rispondono ad un individuo allogenico pMHC ligando è relativamente bassa tra popolazioni di cellule T naive, che presenta una barriera efficace generazione di cloni di cellule T umane sensibili ad un dato antigene.
Identificazione e isolamento di cellule T antigene-specifiche da popolazioni policlonali sono stati abilitati dallo sviluppo di fluoroforo marcata pMHC multimeri 11. Questo approccio utilizza specifici antigeni peptidici caricati in molecole MHC ricombinanti solubili biotinilate, etichettati legandosi ad un fluoroforo streptavidina marcata. Multimerizzazione di pMHC aumenta l'avidità, compensando la intrinsecamente basso (mM) affinità del TCR per ligandi solubili pMHC. Cellule marcate possono essere identificati e isolati mediante citometria a flusso. Tuttavia, questo approccio è ancora limitata dalla bassa frequenza di cellule T antigene-specifiche tra naive popolazioni di cellule T, che sono tipicamenteordini di grandezza inferiore al limite di identificazione accurata e quantificazione sulla maggior citofluorimetri. Per affrontare questa limitazione, un metodo di etichettatura tetramero pMHC e successiva tallone arricchimento magnetico per cellule tetramero-marcato è stato sviluppato 12. Questo metodo ha dimostrato rilevamento affidabile, l'enumerazione, e l'isolamento di cellule T antigene-specifiche bassa frequenza.
Questo protocollo descrive un protocollo efficace per la generazione di cloni di cellule T umane che rispondono specificamente ai singoli ligandi allogenici pMHC. Il protocollo si applica pMHC (HLA) etichettatura Multimer e di arricchimento per l'isolamento di cellule T umane specifiche per alloantigene con citometria a flusso delle cellule di ordinamento e un metodo robusto per la coltura in vitro di cellule T umane per consentire la produzione di cloni di cellule T da cellule ordinati singole ( panoramica nella Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O’Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Fluorophore-labeled pMHC tetramer | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
| EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Human Fc blocking solution | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicin sulfate (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Human AB serum, male donor | Omega Scientific | HS-30 | |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11131D | |
| Media | |||
| Cell sorting buffer | |||
| PBS, pH 7.4 | 1 L | ||
| BSA | 10g | ||
| EDTA (0.5 M) | 2 ml | ||
| Human T Cell Culture Medium | |||
| Iscove's DMEM | 351.6 ml | ||
| Heat-inactivated human AB serum | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100 x) | 4 ml | ||
| Gentamicin (50 mg/ml) | 0.4 ml | ||
| b-mercaptoethanol (14.3 M) | 1.4 ml | ||
| Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) | 1 ml |
Riferimenti
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
- Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
- Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
- Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
- Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
- Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
- Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
- Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
- Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
- Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
- Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
- Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).
