Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

Khujista D. Haque; Atul K. Pandey; Matthew W. Kelley; Chandrakala Puligilla

doi:10.3791/52260

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Articolo metodologico

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

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DOI:

10.3791/52260

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12 gennaio 2015

Khujista D. Haque¹ , Atul K. Pandey¹ , Matthew W. Kelley² , Chandrakala Puligilla¹

¹Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, College of Medicine, ²Laboratory of Cochlear Development, NIDCD, NIH

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un metodo che descrive l'isolamento e la coltura di espianti cocleari dall'orecchio interno di topo embrionale. Dimostriamo anche un metodo per il trasferimento genico in espianti cocleari tramite elettroporazione a onda quadra. La coltura di espianti in vitro abbinata alla tecnica di trasferimento genico consente ai ricercatori di studiare gli effetti dell'alterazione dell'espressione genica durante lo sviluppo.

Abstract

Le cellule ciliate uditive situate all'interno dell'organo del topo di Corti rilevano e trasmettono informazioni sonore al sistema nervoso centrale. Le cellule ciliate meccanosensoriali sono allineate in una fila di cellule ciliate interne e tre file di cellule ciliate esterne che si estendono lungo l'asse basale e apicale della coclea. La tecnica di coltura dell'espiantaggio qui descritta fornisce un metodo efficiente per isolare e mantenere gli espianti cocleari dall'orecchio interno embrionale del topo. Inoltre, la morfologia e le caratteristiche molecolari delle cellule ciliate sensoriali e delle cellule di supporto non sensoriali all'interno delle colture di espianti cocleari assomigliano a quelle osservate in vivo e possono essere studiate all'interno del suo ambiente cellulare intrinseco. Gli espianti cocleari possono fungere da importanti strumenti sperimentali per l'identificazione e la caratterizzazione di percorsi molecolari e genetici coinvolti nella specificazione e nel patterning cellulare. Sebbene i modelli murini transgenici forniscano un approccio efficace per gli studi sull'espressione genica, un numero considerevole di mutanti di topo muore durante lo sviluppo embrionale, ostacolando così l'analisi e l'interpretazione dei fenotipi dello sviluppo. L'organo di Corti proveniente da topi mutanti che muoiono prima della nascita può essere coltivato in modo da poter analizzare il loro sviluppo in vitro e le risposte a diversi fattori. Inoltre, descriviamo una tecnica per l'elettroporazione di espianti cocleari embrionali ex vivo che può essere utilizzata per sottoregolare o sovraesprimere geni specifici e analizzare la loro potenziale funzione endogena e verificare se un prodotto genico specifico è necessario o sufficiente in un determinato contesto per influenzare lo sviluppo cocleare dei mammiferi^1-8.

Introduzione

L'organo mammifero di Corti è composto da un mosaico di tipi di cellule specializzate, tra cui due tipi di cellule ciliate meccanosensoriali e almeno quattro tipi di cellule di supporto non sensoriali che lo rendono un sistema modello ideale per studiare i normali processi cellulari come la proliferazione, la specificazione del destino, la differenziazione e il patterning. Inoltre, il normale sviluppo di questi diversi tipi di cellule è essenziale per la normale funzione uditiva. Pertanto, è fondamentale comprendere i fattori, sia molecolari che cellulari, che ne regolano lo sviluppo. Tuttavia, le piccole dimensioni della coclea di topo e la sua inaccessibilità rappre....