ОТВЕТСТВЕННОСТЬ пигментного эпителия сетчатки (НПП) и из индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) клетки по-разному размеры эмбриональных телец
Summary
Цель настоящего доклада состоит в описании протоколов для получения пигментного эпителия сетчатки (НПП) и из индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток, используя различные размеры эмбриональных органов.
Abstract
Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.
Introduction
Индуцированные плюрипотентные стволовые (IPS) клетки типа плюрипотентных стволовых клеток, полученных путем перепрограммирования взрослых клеток с внешними факторами 1. В отличие от этого, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), другой тип плюрипотентных стволовых клеток, которые генерируются из внутренней клеточной массы бластоцисты 2-3. Несмотря на их различное происхождение, плюрипотентных клеток и ЭСК сравнимы по их неограниченной мощности, чтобы воспроизвести в пробирке и в их способности дифференцироваться в любой тип клеток 4-5. Эти характеристики плюрипотентных клеток делает их идеальными кандидатами для применения в персональной регенеративной медицины. Последние научно-исследовательские работы сосредоточены на разработке надежных протоколов дифференциации по производству специализированных взрослых клеток, включая пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) 6-11.
Для потенциальных клинических применений плюрипотентных клеток, полученных, направленной дифференцировки для этого конкретного типа клеток является существенным. Есть различные методыопубликованы направленной дифференцировки обоих ЭСК и плюрипотентных клеток в ПЭС, что сильно варьируется в их эффективности 6-7, 12-16. Мы до сих пор не знаю, что многие из молекулярных событий, которые регулируют судьбу клеток / ткани в процессе развития или дифференциации. В последние годы, были предприняты усилия для разработки протокола дифференцировки, которые могут имитировать эмбрионального развития, как это возможно. В бластоцисты фазе, неизрасходованный население стволовых клеток вместе в трехмерной микросреде. Таким образом, различные стратегии были применены, чтобы сделать клетки ESC / IPS собраны вместе и расти их в трех измерениях. Эти стволовых клеток агрегаты называются эмбриональные органы (EBS). Исследования показали, что EB дифференцировки стволовых клеток имитировать ранней стадии развития эмбриона и могут самопроизвольно привести к примитивной энтодермы на его внешней поверхности. Позже, по мере развития развития Е.Б., дифференцированная клетка фенотипы всех трех зародышевых линий появляются 17-18. Therefore, EBS на основе дифференциации протоколы привлекли много внимания к дифференцировке в пробирке ESC / IPS клетки и хорошим кандидатом для производства НПП из плюрипотентных стволовых клеток 13.
ЭТ можно сделать, используя несколько методов от регулятора / IPS клеток. Первоначально ЭТ были сделаны соскабливания прилипшие колоний и поддержания их в неадгезированных суспензионной культуре. Тем не менее, этот подход дает гетерогенную популяцию ЭТ, что вызывает низкую воспроизводимость. Висячие культуры клеток падение и микролуночный формирование ЭТ основе Другие популярные методы для формирования ЭТ, которые дают однородные ЭТ определенных размеров, которые легко воспроизводимым. Кроме того, этот метод может дать микролуночный большое количество агрегатов с меньшим усилием.
Дифференцирование клеток в ЭТ регулируется мультиплексированием морфогенетических сигналов от внеклеточной и внутриклеточной микросреды. В отличие от дифференциации в Пнolayer формат ЭТ обеспечить платформу для комплексной сборки клеток и межклеточного сигналов, чтобы произойти 17. Интересно, что наблюдалось количество плюрипотентных стволовых клеток, используемых для отдельных ЭТ влиять на судьбу клеток. Например, в кроветворной исследования дифференциации эмбриональных клеток, было отмечено, что 500-клеточной EB стимулирует дифференциацию к миелоидной то время как 1000-клетки EB толкают к эритроидного линии 20. В другом исследовании, меньше ЭТ выступает энтодермы дифференциацию в то время как более крупные ЭТ способствовало к нервно-ктодерму дифференциации 11, 17.
Эти последние исследования убедительно показывают, что число ESC / IPS клеток, используемых для отдельных ЭТ влияют на ЭТ, основанные дифференциацию любых типов клеток. Однако, по нашим сведениям, не существует каких-либо текущих исследований, которые вскрыли влияние размера EBS в своей склонности к дифференциации к ПЭС. Целью данного исследования является описание влиянияEB размер по наведению стебля плюрипотентных (IPS) клеток – пигментный эпителий сетчатки (IPS-РПЭ) дифференциация и определить оптимальное количество клеток, чтобы сделать ЭТ для направленной дифференцировки в сторону НПП линии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для полной реализации обещание плюрипотентных стволовых клеток для клеточной терапии, необходимо регулировать их дифференцировку в последовательной и воспроизводимой образом. Этот отчет описывает протоколы для формирования контролировали по размеру ЭТ с использованием микролуноч…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti- RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | promega | M7502 | |
| High capacity RNA to c DNA kit | Life Technologies | 4387406 | |
Riferimenti
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
