Glutamat og Hypoksi som en Stress Modell for den isolerte perfuserte Vertebrate Retina

Summary

Med denne studien, innfører vi en standardisert stresset modell for den isolerte superfuseres storfe netthinnen for fremtiden preklinisk terapeutisk testing. Effekten av enten hypoksi (rent N ₂₎ eller glutamat stress (250 pM glutamat) på retinal funksjon representert ved a- og b-bølgeamplitudene ble evaluert.

Abstract

Neuroprotection har vært et sterkt felt av etterforskningen i ophthalmological forskning de siste tiårene, og påvirker sykdommer som grønn stær, retinal vaskulær okklusjon, netthinneavløsning, og diabetisk retinopati. Det var formålet med denne studien er å innføre en standardisert spenning modell for framtidig terapeutisk preklinisk testing.

Bovine netthinner ble fremstilt og perfundert med en oksygenmettet standardløsning, og ERG ble registrert. Etter innspillingen stabile b-bølger, hypoksi (ren N ₂₎ eller glutamat stress (250 mikrometer glutamat) ble utøves i 45 min. Å undersøke effekter på fotoreseptoren funksjon alene, ble en mM aspartat tilsettes for å oppnå en-bølger. ERG-gjenvinning ble overvåket i 75 min.

For hypoksi, ble en reduksjon i a-bølgeamplituden på 87.0% bemerkes (p <0,01) etter en eksponeringstiden på 45 minutter (reduksjon på 36,5% etter slutten av utvaskings p = 0,03). I tillegg kan en innledende redusere påvirkerletthet i b-bølgeamplitudene av 87,23% ble registrert, som nådde statistisk signifikans (p <0,01, reduksjon på 25,5% ved utgangen av utvasking, p = 0,03).

For 250 um glutamat, en innledende 7,8% reduksjon av a-bølgeamplitudene (p> 0.05) etterfulgt av en reduksjon på 1,9% (p> 0,05). En reduksjon på 83,7% av b-bølgeamplitudene (p <0,01) ble observert; etter en utvasking av 75 min reduksjonen var 2,3% (p = 0,62). I denne studien, er et standardisert stresset modell presenteres som kan være nyttig for å identifisere mulige nervecellene effekter i fremtiden.

Introduction

Neuroprotection har vært et sterkt felt av etterforskningen i ophthalmological forskning de siste tiårene. Netthinnen er en svært følsom nevronale nettverk som avhenger i stor grad oksygenering og påvirkes sterkt av metabolismen av dens omkringliggende celler. Store okulær patologi knyttet til nervecelleskade er retinal vaskulær okklusjon, glaukom, og netthinneavløsning.

Retinal arterieokklusjon, som et eksempel for retinal vaskulær okklusjon, fører til et plutselig tap av syn på grunn av hypoksi av den indre retina ^1. Det er ofte forbundet med generelle vaskulære sykdommer ² og fører til en vedvarende synstap ^1, med bare 8% av pasienter utvinne synsskarphet betydelig ^en. Selv arteriell fibrinolyse har blitt foreslått som et alternativ behandling, kan fordelen ikke bli vist i en randomisert klinisk studie ^tre.

Glaukom og netthinneavløsningbegge har en økning i glutamatkonsentrasjon ^4-6. Glutamat henhold fysiologiske betingelser påtreffes som en eksitatorisk transmitter i hele sentralnervesystemet og det indre retina ^7,8. Forhøyede glutamatnivået har blitt funnet ikke bare i grønn stær og netthinneavløsning ^5,6, men også i proliferativ diabetisk retinopati ^9. En økning av glutamat muligens fører til eksitotoksisitet og derfor nervecelleskade ^10. I de fleste tilfeller av netthinneavløsning og i noen tilfeller av proliferativ diabetisk retinopati kirurgi på netthinnen (pars plana vitrektomi) er nødvendig. Under pars plana vitrektomi mekanisk manipulasjon, lyse lys av den optiske fiber eller skjærspenning utøves av høye strømningsrater vanningsløsninger under lange operasjoner utøve en ekstra stress på netthinnen ^11,12.

Alle de nevnte sykdommer, har til felles at patologien er lokalisert til Retinen alene og utgjør den ophthalmologic samfunn med utfordringen å finne måter å beskytte netthinnen som en nevro system.

Elektroretinogrammet (ERG) er standardmetoden for evaluering av in vivo fotoreseptoren funksjon (a-bølge), og funksjonen av den indre retina (B-bølge). ERG måles ved sølv-elektroder som føres inn i hornhinnen, og øynene blir stimulert av en økende grad av lys for å detektere defekter i stenger eller kjegler, eller i det indre netthinnen. Forskjellige defekter i netthinnen kan påvises ved endringer i amplitude (styrken på responsen) eller latens (tiden til respons-intervall) av ERG. Ulike ERG protokollen og målemetoder (mønster-ERG, multifokal-ERG eller lyse felt ERG) tillate ytterligere differensiering av defekter. Teknikken med den isolerte hinnen er innført nylig, noe som gjør det mulig å evaluere effekter på netthinnen uten interferens fra f.eks en studie dyretsgenerelle reaksjoner ^13,14.

Det var formålet med denne studie for å evaluere og innføre en definert og standardisert spenning modell for hypoksi og glutamat stress på superfuseres isolert hinnen. Dermed håper vi å legge grunnlaget for fremtidige studier av nervecellene effekter av enkelte agenter eller intraokulære vanningsløsninger.

Protocol

1. Utarbeidelse av storfe Eyes Skaff storfe øyne rett etter at dyret er slaktet. Transportere de beskyttede øyne "Sickel-oppløsning" et spesielt medium inneholdende 120 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2, 1,5 mM NaH 2PO 4, 13,5 mM Na HPO 2 4 og 5 mM glukose RT. Utføre utarbeidelsen av netthinnen under mørke tilpasset forhold med en svakt rødt lys. Fjern den fremre del av øyet. Utfør en ekvatorial snitt ca. …

Representative Results

Etter en time av perfusjon av netthinnens preparater med oksygenmettet standardløsning (figur 1A og B) ERG-amplituder viste stabilisering og mindre variasjon av amplituder mellom enkeltmålinger. pH, osmotisk trykk, temperatur og pO 2 (med unntak av hypoksi testing) ble holdt konstant i alle tester. For å isolere den fotoreseptoren signal fra signalet fra den indre hinnen, ble 1 mM aspartat tilsatt til standardløsningen for å undertrykke b-bølgen (figur 1A).<…

Discussion

I denne studien ble en betydelig innvirkning på b-wave amplitude etter 45 min av hypoksi funnet. Denne reduksjonen var fortsatt signifikant etter utvasking fasen. En lignende effekt på fotoreseptoren potensial kunne observeres.

Resultatene støttes av andre publiserte data ¹⁶ og gir oss mulighet til å studere mulige nervecellene effekter etter hypoksi.

Etter 45 min utstilling av 250 mikrometer glutamat, fant vi en statistisk signifikant innvirkning …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
120 mM NaCl	Merck Pharma, Germany	1,064,041,000
2 mM KCl,	Merck Pharma, Germany	1,050,010,250
0.1 mM MgCl2,	Merck Pharma, Germany	58,330,250
0.15 mM CaCl2	Merck Pharma, Germany	111 TA106282
1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4	Merck Pharma, Germany	1,065,860,500
5 mM glucose	Merck Pharma, Germany	40,741,000