蛍光DNAための簡単な方法<em>その場で</em>ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション
Summary
Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.
Abstract
in situハイブリダイゼーション （DNA ISH） における DNAは、特定の染色体領域にシーケンスをマッピングするために一般的に使用される方法である。このアプローチは、計算上のアプローチが法外な課題に直面してヘテロクロマチン領域にマッピング高度反復配列に特に有効である。ここでは、他のDNA ISHプロトコルにおける標準手順ですホルムアミドの洗浄を回避するDNA ISHのための合理化されたプロトコルを記述します。我々のプロトコルは、効果的に異なる昆虫の組織タイプの数にわたって異質染色体領域内の反復DNA配列をマークする蛍光色素を担持する短い一本鎖DNAプローブとのハイブリダイゼーションのために最適化されている。しかし、アプリケーションは、単一コピーの大きいプローブおよび可視化（非反復）のDNA配列で使用するように拡張することができる。私たちは、 キイロショウジョウバエの神経細胞とキョウから押しつぶされた染色体に複数の異なる反復配列をマッピングすることにより、この方法を実証するvitripennis精母。我々は両方の小、商業的に合成されたプローブの比較のために、より大きなプローブのハイブリダイゼーションパターンを示している。この手順は、単純な実験室用品および試薬を使用し、DNA ISHを実施するとの経験がほとんどない研究者に最適です。
Introduction
in situハイブリダイゼーション （DNA ISH） における DNAは、特定の染色体領域にシーケンスをマッピングするために一般的に使用される方法である。長いDNA生成物1,2及びdeoxygeninの取り込みのニックトランスレーションまたは末端標識（DIG）を含む、ユークロマチン内の単一コピー領域へのプローブのアプローチの一握りを介して生成することができますが、多種多様を通じてヌクレオチドおよびそれらの認識を-attachedグループ標識抗体1-3。少数または単一のコピー数の真正染色質系列の可視化は、高い特異的活性または集合シグナルを増強複数の、より小さなプローブのカクテルを持つ単一の、大規模なプローブのいずれかを使用する必要があります。
彼らは通常、数万のブロックとして知られている単一の染色体領域に密集反復の千として存在しているのでこれとは対照的に、そのようなサテライトDNAとしてヘテロクロマチンに見られる高度反復配列は、DNA ISHのために簡単にターゲットである。転移因子はまた、であることができる明確な染色体遺伝子座2で高コピー数で発見。これらのケースでは、低い比活性を持つ単一のプローブは、効果的に複数のサイトで彼らのハイブリダイゼーションのためにヘテロクロマチン系列ラベルを付けることができます。反復配列に対するプローブは、市販の短いオリゴヌクレオチド（30-50 bp）を合成し、化学的に異なる複数の蛍光性基のいずれかと結合体化され得る。ゲノム配列決定技術を用いて、ヘテロクロマチン内の反復配列をマッピングすることにより、高度に反復的な衛星のブロック4-6,7内の建物の足場で遭遇する課題には困難である。現在、ISHは、サブ染色体レベルでのこれらの配列をマッピングする最も効果的な方法として表す。この戦略は、進行中のゲノム及びトランスクリプトーム配列決定研究によって明らかにされている反復配列の多数をマッピングするために重要である。
スライドマウント染色体上の反復配列のマッピングの効率および容易さがGREであろうatly DNA ISHのために単純化されたプロトコルによって強化。例えば、DNA ISHのための既存のプロトコルは、このようにマッピングシーケンスの所要時間と実質的に添加しても高価な試薬のための化学廃棄物を大量に産生する、ホルムアミド溶液中でハイブリダイズ2,8組織の複数回の洗浄を含む。ここでは、ホルムアミドの洗浄の必要性を回避し、基本的な実験装置および試薬を利用して修正されたDNA ISH方法について説明します。この方法は、本来の蛍光色素とコンジュゲートしている、商業的に合成されたオリゴを用いて、 ショウジョウバエ幼虫の神経芽細胞の異質領域において高度に反復DNA配列の迅速なマッピングのために設計された。しかし、この方法はまた、他の手段9,10を介して、複数の異なる組織及び染色体タイプにわたって合成された大きいプローブを使用して反復配列をマッピングするために働く。さらに、この方法は、より長いまたはmultip使用してユークロマチンシーケンスをマッピングするために使用することができるル、関心の真正染色質配列内に短いプローブ。
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA ISHは、しばしば、染色体に特異的な配列をマッピングするために使用される。我々は、高コピー数、ヘテロクロマチンの配列のために最適化DNA ISHのための簡単な方法を記載している。むしろ、他の既存のDNA ISHプロトコールにおいて必要条件で、ホルムアミド溶液中での洗浄を使用するのではなく、我々は、DNAを変性させるために予め加熱されたブロックに直接組織に取り付けられた…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.
Materials
| Company | |
| Materials | |
| Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) | Sigma Aldrich |
| Ultrafine tweezers (5 gauge) | Dumont |
| 22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear | Fisher |
| Sigmacote | Sigma |
| Filter paper (75-150mm) | |
| Paraffin wax paper | |
| Heat block with thermometer | |
| Dry incubator | |
| Razor blades | |
| Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes) | |
| Coplin jars (with slide grooves) | |
| Aluminum foil | |
| Pasteur pipettes | |
| 1.5 mL microfuge tubes | |
| Nail polish (clear or colored) | |
| 2-20 μL micropipette and plastic tips | |
| 20-25 standard metal paperclips linked to form a chain | |
| Company/Notes | |
| Reagents | |
| 16% EM grade paraformaldehyde | Electron Microscopy Reagents |
| Acetic acid | Sigma |
| Liquid nitrogen | |
| 100% Ethanol, chemical grade | |
| Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos | |
| Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen) | Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe) | Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Hybridization buffer | Recipe below |
| 4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween) | Recipe below |
| 0.1X SSC (Saline-sodium citrate) | Recipe below |
| Blocking solution | Recipe below |
| SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween) | Recipe below |
| 1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween) | Recipe below |
| 1X PBS (Phosphate-buffered saline) | |
| Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O) | |
| Formamide | Sigma Aldrich |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector laboratories |
Riferimenti
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