Método simple de ADN de fluorescencia<em> In Situ</em> Hibridación a los cromosomas aplastado
Summary
Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.
Abstract
ADN hibridación in situ (ISH ADN) es un método comúnmente utilizado para las secuencias de mapeo a regiones específicas de cromosomas. Este enfoque es particularmente eficaz en la cartografía de secuencias altamente repetitivas a heterochromatic regiones, donde los enfoques computacionales enfrentan desafíos prohibitivos. Aquí se describe un protocolo simplificado para ADN ISH que elude lavados de formamida que son medidas estándar en otros protocolos de ADN ISH. El protocolo se ha optimizado para la hibridación con sondas de ADN monocatenario cortos que llevan colorantes fluorescentes, que marcan efectivamente secuencias repetitivas de ADN dentro de las regiones cromosómicas heterocromatínicas a través de un número de diferentes tipos de tejidos de insectos. Sin embargo, las solicitudes podrán hacerse extensivas a utilizar con sondas de mayor tamaño y la visualización de las secuencias de ADN de copia única (no repetitiva). Demostramos este método mediante la asignación de varios diferentes secuencias repetitivas a los cromosomas de Drosophila melanogaster aplastadas células neuronales y Nasoniavitripennis espermatocitos. Mostramos los patrones de hibridación de ambas sondas pequeñas, sintetizados en el mercado y para una sonda grande para la comparación. Este procedimiento utiliza insumos de laboratorio sencillas y reactivos, y es ideal para los investigadores que tienen poca experiencia con la realización de ADN ISH.
Introduction
ADN hibridación in situ (ISH ADN) es un método comúnmente utilizado para las secuencias de mapeo a regiones específicas de cromosomas. Las sondas a las regiones de copia única dentro de la eucromatina se pueden generar a través de un puñado de enfoques, incluyendo nick-traducción o extremo etiquetado de los productos de ADN largas de 1,2 y la incorporación de deoxygenin (DIG) nucleótidos, adscritos y su reconocimiento a través de una amplia variedad de anticuerpos de grupo-conjugado 1-3. La visualización de secuencias euchromatic en pocos o un solo número de copias requiere el uso de cualquiera de las sondas individuales, grandes con alta actividad específica o un cóctel de múltiples sondas, más pequeñas que mejoran colectivamente señal.
En contraste, las secuencias altamente repetitivas que se encuentran en la heterocromatina, como ADN satélite, son blancos más fáciles para el ADN ISH porque normalmente existen como decenas de miles de repeticiones agrupadas en regiones cromosómicas individuales conocidos como bloques. Los elementos transponibles pueden ser tambiénque se encuentra en alto número de copias en distintos loci cromosómicos 2. En estos casos, las sondas individuales con baja actividad específica pueden etiquetar con eficacia heterochromatic secuencias debido a su hibridación en múltiples sitios. Las sondas a secuencias repetitivas pueden sintetizarse oligonucleótidos comercialmente como cortas (30-50 pb) y químicamente conjugados con cualquiera de los múltiples grupos fluorescentes diferentes. Mapeo secuencias repetitivas dentro de heterocromatina utilizando tecnologías de secuenciación del genoma es difícil debido a los problemas encontrados en los andamios de construcción dentro de los bloques de satélite altamente repetitivas 4-6,7. Actualmente, ISH se erige como la forma más efectiva de cartografía de estas secuencias a nivel sub-cromosoma. Esta estrategia es importante para el mapeo de un gran número de secuencias repetitivas que están siendo descubiertas por los estudios de secuenciación del genoma y transcriptoma en curso.
La eficiencia y la facilidad de mapeo secuencias repetitivas en los cromosomas de diapositivas montadas serían greatly mejorada por un protocolo simplificado para el ADN ISH. Por ejemplo, los protocolos existentes para el ADN ISH implican múltiples lavados de tejidos hibridados en solución de formamida 2,8, añadiendo así sustancialmente el tiempo requerido para las secuencias de cartografía y también la producción de grandes cantidades de residuos químicos para este reactivo costoso. Aquí se describe un método de ADN ISH revisado que evita la necesidad de lavados de formamida y utiliza equipos y reactivos de laboratorio básico. Este método fue diseñado originalmente para la rápida detección de las secuencias de ADN altamente repetitivas en las regiones heterocromáticas de neuroblastos de larvas de Drosophila mediante el uso de oligos sintetizados comercialmente que se conjugan con los tintes de fluorescencia. Sin embargo, este método también funciona para el mapeo de secuencias repetitivas mediante el uso de sondas más grandes sintetizados a través de otros medios de 9,10 y a través de múltiples diferentes tipos de tejidos y de cromosomas. Además, este método se puede utilizar para mapear secuencias euchromatic mediante el uso de más largo o multíparale, sondas cortas dentro de la secuencia euchromatic de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
ADN ISH se utiliza con frecuencia para mapear secuencias específicas a los cromosomas. Hemos descrito un método sencillo para el ADN ISH optimizado para alto número de copias, heterochromatic secuencias. En lugar de usar lavados en una solución de formamida, que es un requisito en otros protocolos de ISH de ADN existentes, ponemos diapositivas montado de tejidos directamente en un bloque de pre-calentada para desnaturalizar el ADN. Este método evita el uso de grandes cantidades de formamida. Un paso fundamental par…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.
Materials
| Company | |
| Materials | |
| Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) | Sigma Aldrich |
| Ultrafine tweezers (5 gauge) | Dumont |
| 22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear | Fisher |
| Sigmacote | Sigma |
| Filter paper (75-150mm) | |
| Paraffin wax paper | |
| Heat block with thermometer | |
| Dry incubator | |
| Razor blades | |
| Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes) | |
| Coplin jars (with slide grooves) | |
| Aluminum foil | |
| Pasteur pipettes | |
| 1.5 mL microfuge tubes | |
| Nail polish (clear or colored) | |
| 2-20 μL micropipette and plastic tips | |
| 20-25 standard metal paperclips linked to form a chain | |
| Company/Notes | |
| Reagents | |
| 16% EM grade paraformaldehyde | Electron Microscopy Reagents |
| Acetic acid | Sigma |
| Liquid nitrogen | |
| 100% Ethanol, chemical grade | |
| Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos | |
| Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen) | Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe) | Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Hybridization buffer | Recipe below |
| 4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween) | Recipe below |
| 0.1X SSC (Saline-sodium citrate) | Recipe below |
| Blocking solution | Recipe below |
| SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween) | Recipe below |
| 1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween) | Recipe below |
| 1X PBS (Phosphate-buffered saline) | |
| Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O) | |
| Formamide | Sigma Aldrich |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector laboratories |
Riferimenti
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