تقييم الانتقائية مرنا الترجمة في خلايا الثدييات من قبل Polysome التنميط
Summary
The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.
Abstract
تنظيم تخليق البروتين يمثل نقطة السيطرة الرئيسية في استجابة الخلايا للإجهاد. على وجه الخصوص، وقد أظهرت العناصر التنظيمية RNA سرية للسماح لترجمة انتقائية من mRNAs محددة، والتي عادة لترميز البروتينات اللازمة للاستجابة الإجهاد معينة. وقد تم تحديد هذه من mRNAs، فضلا عن توصيف الآليات التنظيمية المسؤولة عن الترجمة الانتقائية في طليعة البيولوجيا الجزيئية لبعض الوقت. التنميط Polysome هي طريقة حجر الزاوية في هذه الدراسات. هدف التنميط polysome هو الاستيلاء على الترجمة مرنا من قبل شل حركة ريبوسوم بنشاط في ترجمة النصوص المختلفة، وفصل polyribosomes الناجم عن تنبيذ فائق على التدرج السكروز، مما يسمح للتمييز بين النصوص المترجمة للغاية ومنها ترجمت بشكل سيئ. هذه يمكن بعد ذلك تتميز بمزيد من طرق البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية التقليدية. الأهم من ذلك، يجمع صolysome التنميط مع النهج الجينومية إنتاجية عالية يسمح لتحليل واسع النطاق لتنظيم متعدية.
Introduction
تنظيم تخليق البروتين (الترجمة) هو عملية الخلوية الأساسية التي ترتبط ارتباطا وثيقا بقاء الخلوية. بالنظر إلى أن الترجمة تستهلك أكثر من 50٪ من طاقة الخلية، فإنه ليس من المستغرب أن الترجمة ينظم بإحكام وأن الاضطرابات في الترجمة لا تحملها جيدا. على العكس، تتطلب العديد من العمليات الخلوية الشاذة التي الماكينات الترجمة والإخراج الترجمة (أي بروتيوم) لا بد من تعديلها. هذا هو الحال غالبا في مختلف الدول استجابة الإجهاد والمرض، وربما الأفضل يتمثل في السرطان. والميزة الرئيسية للرقابة متعدية هي قدرة الخلايا على إعادة برمجة بسرعة إخراج البروتين ردا على مختلف المثيرات الخارجية والداخلية، وآلية ضبط بالتالي الجميلة التي نصائح التوازن بين بقاء الخلية والموت 1.
جانبين من جوانب الرقابة متعدية مثيرة للاهتمام بشكل خاص. فهم طبيعة MEC التنظيميhanism (ق) وضبط العناصر التي تسمح للترجمة محددة، وتحديد من mRNAs محددة ومنتجاتها البروتينية التي تشارك في الاستجابة الخلوية لالزناد خاص التي أثارت الترجمة الانتقائية في المقام الأول. التنميط Polysome هو الاسلوب الذي يسمح بدراسة فعالة من العمليتين.
الهدف العام من هذه التقنية التنميط polysome هو دراسة وقياس حالة ترجمة من mRNAs محددة في ظل ظروف الخلوية المختلفة. مبدأ هذه التقنية هو الاستيلاء على الترجمة مرنا من قبل '' تجميد 'بنشاط على ريبوسوم ترجمة النصوص المختلفة، وفصل polyribosomes الناجم عن تنبيذ فائق على التدرج السكروز، مما يسمح للتمييز بين النصوص المترجمة للغاية (ملزمة عدة ريبوسوم) و ترجمة سيئة منها (ملزمة من جانب واحد أو اثنين من ريبوسوم). في هذا بروتوكول معين، سيكلوهيكسيميد المضادات الحيوية التي تربط ل60S الوحيدات الريباسي وكتل الافراج عن deacetylated الحمض الريبي النووي النقال من موقع E الريبوسوم 2، ويستخدم لمنع النبات الريبوسوم والمماطلة على ريبوسوم من mRNAs ترجمة. ومع ذلك، منع وكلاء آخرين مثل إيميتين أن الترجمة أيضا كتل استطالة 3، يمكن استخدامها.
على عكس النشاف الغربي و 35 S-ميثيونين تقنيات وضع العلامات لقياس الناتج النهائي لعملية الترجمة، polysome التنميط له ميزة قياس الارتباط مع ريبوسوم من mRNAs ترجمة نشطة، وبالتالي السماح لدراسة أكثر تفصيلا لآليات الترجمة تحت ظروف مختلفة. وبالتالي، فإن تقنية يمكن تكييفها بسهولة لدراسة تحديدا وسائط مختلفة الترجمة 4-6 والعوامل البروتينات تشارك في تنظيم الترجمة 7-9، وظروف الإجهاد التي تؤثر على تخليق البروتين 1،10،11 أو آثار الهياكل مرنا مثل IRES أو المنبع إطارات القراءة المفتوحة على البروتين موالفةESIS 12-14. في الوقت الحاضر، polysome تطبيقات التنميط، بل هي أوسع مع استخدام الحمض النووي ميكروأرس 15 أو الجيل المقبل من التسلسل 16،17 لتحليل المرتبطة polysomes-من mRNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
التنميط Polysomal هي تقنية قوية تسمح لتقدير الدولة لترجمة النصوص محددة تحت ظروف معالجة مختلفة. إنها تقنية بسيطة جدا من حيث المبدأ إلا أنه يتطلب عدة خطوات التنفيذ، وبعضها بالغ الأهمية لإنتاج لمحات polysome جيدة. الخطوات الرئيسية هي: 1) استخدام المواد الكيميائية ريبونوكلياز خالية وبلستيكور، 2) إعداد التدرجات السكروز جيدة (في تجربتنا 10-50٪ التدرجات السكروز عمل أفضل لحل بكفاءة 40 / 60S مفارز من mRNAs ومع ريبوسوم منضمة)، و 3 ) باستخدام الخلايا التي تنمو باطراد وليس أكثر من 80٪ متموجة من أجل الاستيلاء على أعلى معدلات الترجمة. ينبغي اتخاذ هذه الخطوة الأخيرة في الاعتبار عند القيام العلاج بالخلايا طويلة، مثل ضربة قاضية الجينات أو overexpression، بحيث أن كمية الخلايا لوحة ستكون وظيفة لمدى سيتم متموجة الخلايا عند نقطة النهاية.
في نتائج حاضراهنا، كان تيد polysome تحليل الشخصية أداة هامة لتقييم دور PDCD4 في تنظيم ترجمة من mRNAs XIAP وبي سي-XL 12 بإيواء IRES. حقيقة أننا لم نلاحظ أي تغيير في الملامح العامة على polysome PDCD4 تدق إلى أسفل (الشكل 1B) يسمح لنا أن نستنتج أن PDCD4 لم يضعف الترجمة الخلوية العالمية في ظل ظروف التجربة. كنا بجوار تحليل RT-QPCR لتحديد توزيع XIAP وبي سي-XL من mRNAs في الخلايا تعامل مع PDCD4 أو الرناوات siRNAs السيطرة. QPCR هو الأسلوب المفضل لتحليل الشخصية polysome، خلافا لمعيار RT-PCR أو النشاف الشمالي، لأنه يسمح لكمية بدلا من التحليل شبه الكمي للتوزيع مرنا وللكشف عن التحولات الطفيفة في كفاءة متعدية بين العلاجات. باستخدام هذه التقنية، تمكنا من إظهار أن توزيع XIAP وبي سي-XL من mRNAs (كنسبة مئوية من إجمالي مرنا الهدف عبر غراممتجه نحو المنبه) وقد تحولت بشكل كبير إلى polyribosomes الثقيلة (من mRNAs مع عدد كبير من الريبوسومات المرتبطة بها) بعد PDCD4 تدق إلى أسفل (الشكل 1D، E)، مما يشير إلى زيادة في ترجمة هذه من mRNAs. وقد أكد هذا أيضا زيادة في XIAP وبي سي-XL مستويات البروتين ولكن ليس في مستويات RNA الحالة المستقرة لها (الشكل 1F، G). الأهم من ذلك، كان توزيع polysome من البديل غير IRES من XIAP دون تغيير بين الخلايا المعالجة وغير المعالجة (الشكل 1C). بدلا من ذلك، يمكن تقديم كفاءة متعدية كنسبة من المحتوى مرنا في polysomes (الكسور عادة ما بين 5 و 10) مقابل monosomes (عادة كسور 2 إلى 4) 14.
استخدام الضوابط في جميع أنحاء بروتوكول مهم في التحقق من صحة أي polysome التنميط النتيجة، كما لا يمكن بمفردها أن يعزى قمم لوحظ من قراءات الامتصاصية في 254 نانومتر إلى RNA الريباسي (المنظفاتS، مثل تريتون X-100 تمتص بقوة في هذه المنطقة من الطيف وربما يحجب 40 / 60S قمم في قمة التدرج). التدرجات فارغة دون المحللة و / أو مع العازلة المحللة تحتاج إلى أن تدار لتحديد المساهمة النسبية للمخازن إلى الامتصاصية في 254 نانومتر. مصطنع الهياكل ترتيب أعلى يمكن أيضا أن تؤدي إلى تفسيرات خاطئة للpolysomes حيث توجد في الواقع لا شيء (على سبيل المثال "شبه polysomes" 20). امتصاص المغنيسيوم (التي تستخدم في جميع أنحاء الداخلي لتحقيق الاستقرار ريبوسوم 80S) مع EDTA ثنائي التكافؤ الموجبة خالب وأضاف أن ولست] إلى المخزن المؤقت التدرج (20 ملم لمدة 15 دقيقة) سوف يسبب فصل الريبوسوم إلى مكوناته الصغيرة (40S) والكبيرة (60S ) مفارز. وبالتالي، إذا قمم الامتصاصية سجلت في 260 نانومتر هي في الواقع polysomes، سوف تنهار العلاج EDTA بحيث لا تتجاوز واحد وسيراعى بالقرب من أعلى التدرج الذي يتوافق مع تحرير مرنا وحدات الريباسي في الملف (لا تظهر البيانات). متماكنمع الانهيار الناجم عن EDTA من الوضع، كل أهداف محددة تحليلها من قبل QPCR الآن يجب أن توجد في الجزء العلوي من التدرج.
عدد ريبوسوم المرتبطة مرنا ليست دائما مؤشرا على مدى كفاءة مرنا بشكل خاص أن يتم ترجمتها. في الواقع، هناك سياقات محددة فيها الترجمة النشطة في polysomes يصبح توقفت 21،22 والتي ينبغي أن يكون القارئ على علم. تحديد ما إذا كان أو لم يكن النصوص وتشارك بنشاط مع الترجمة الآلية يمكن أن تقوم به أ) معالجة العينة مع بوروميسين، والتي خلافا EDTA، يسبب "الاعادة" من ريبوسوم التي translocating بنشاط عبر مرنا، أو ب) معالجة عينة مع homoharringtonine الذي يحول النبات فقط الريبوسوم الأول في كودون البداية، مما تسبب في "جولة الإعادة" أي ريبوسوم translocating المصب مرة أخرى.
استخدام النصوص السيطرة لتحليل QPCR أمر بالغ الأهمية أيضا. وSELECنشوئها من النصوص التي لا تتأثر بالظروف معاملة مختلفة مثل بعض الجينات التدبير المنزلي (GAPDH، أكتين، تويولين، نوكليولين)، من mRNAs الريباسي (18S، RPL13A) أو في هذه الحالة البديل غير IRES للXIAP IRES، المهم في التحقق اذا تأثير العلاج على الترجمة هو محدد أو تعميمها. هذه النصوص تحكم يمكن استخدامها لتطبيع توزيع من mRNAs تحليلها كما حدث هنا (تم تطبيع XIAP وبي سي-XL من mRNAs إلى GAPDH مرنا ويعبر عنه كنسبة مئوية من إجمالي المحتوى مرنا يمثلها مجموع المحتوى مرنا في كل جزء ) أو بدلا من ذلك، الهدف والسيطرة من mRNAs يمكن التعبير عن القيم المطلقة وتظهر بشكل منفصل. تحليل QPCR من المدخلات لست] (عادة 10٪ من الحجم الكلي) هو خطوة أخرى من شأنها أن تحكم لتوزيع من mRNAs محددة. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون مرنا من المحتوى لنص معين في المحللة مدخلات تعادل مجموع المحتوى مرنا في جميع الكسور 10 تحليلها. أخيرا، وهي خطوة اختيارية للتحكم عن الفينول: خطوة استخراج الكلوروفورم هي ارتفاع كل جزء polysome مع مرنا في المختبر كتب مراسل (مثل اتفاقية مناهضة التعذيب، الكلورامفينيكول ترانسفيراز الاسيتيل) التي سيتم قياسها لاحقا QPCR ويمكن حتى أن تستخدم للتطبيع البيانات 14.
كما هو الحال مع أي تقنية، يقدم التنميط polysome بعض القيود. الحقيقة التي عادة ما لا يقل عن 10 الكسور (قد يتطلب تحولات أكثر دهاء في كفاءة الترجمة 20 أو أكثر) تحتاج إلى جمعها من أجل الحصول على توزيعات polysome طيبة يجعل هذه الخطوة تحد، بمعنى أنه فقط كحد أقصى من 4 عينات يمكن أن يكون تحليلها في وقت لتكون قادرة على التعامل بشكل مريح استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل 40 عينة من QPCR والضوابط 4 المدخلات في وقت واحد. حجم العينة يمكن أن تضيف بسهولة مع عدد من النصوص لتحليلها وعدد QPCR يكرر القيام به، وهذا يمكن أن يكون مكلفا. آخر الحد من polysomal مقرها QPCR-التنميط وnalysis هو أنه لا يمكن أن يتم إلا على النهج القائم على مرشح (حيث يتم تحليل النصوص إلى معروفة مسبقا) والتي لا يمكن تطبيقها لتحليل الجينوم على نطاق الترجمة. ومع ذلك، في بداية القرن 21، بدأ المحققون في استجواب RNA polysomal بهم على المستوى الجيني باستخدام الحمض النووي ميكروأرس 15، ومؤخرا مع الجيل المقبل من التسلسل 16،17. في هذا النهج القوي، يتم إجراء التنميط polysomal كما هو موضح في هذا البروتوكول إلا أنه بدلا من إجراء تحليل QPCR الكسور الفردية، monosomes الكسور (عادة جزء 2-4) وpolysomes الكسور (عادة كسور) يتم تجميع معا والاختلافات في الترجمة العالمية حلل بواسطة ميكروأري DNA أو RNA كامل الجينوم التسلسل. وبالتالي مع هذا النهج، فمن الممكن لتقييم كل من mRNAs التي التوزيع التحولات من polysomes لmonosomes (النقص في الترجمة) أو العكس (زيادة في الترجمة) على علاج معينمنة. ويمكن بعد ذلك أن يتم التحقق من صحة النوعي والكمي لتوزيع polysomes مرنا محدد من QPCR. لاستخدام أكثر قوة من مبدأ التنميط polysomal هو التنميط الريبوسوم. وأفادت التقارير أيضا تمديد إنتاجية عالية من هذه التقنية في الآونة الأخيرة التي تسمح للرصد في وقت واحد من مئات polysome الكسور 23. وهذا يوفر ميزة واضحة عند تحقق الكفاءة متعدية مجموعات متحولة أو في شاشات رني على نطاق واسع. التنميط الريبوسوم هو الاسلوب الذي يستفيد من الجيل القادم لتسلسل الخريطة شظايا الحمض النووي الريبي التي تحميها ريبوسوم (آثار أقدام الريبوسوم) تشارك في تخليق البروتين 24،25. في هذه التقنية، يمكن أن تحول دون النبات الريبوسوم مع سيكلوهيكسيميد (عكسها) أو إيميتين (لا رجعة فيه)، يليه تحلل الخلايا وريبونوكلياز الهضم لانتاج عدد سكانها آثار أقدام الريبوسوم. يتم إثراء ريبوسوم، يتم عزل الحمض النووي الريبي مجموع، وتتم إزالة تلوث الريباسي وRNA الريباسي الميتوكوندريا.آثار أقدام RNA حوالي 26-28 النيوكليوتيدات هي معزولة، عكس كتب، وتحويلها إلى مكتبة [كدنا] والتسلسل 26. عكس polysome التنميط القياسية، وهذا النهج ليس فقط يحدد من mRNAs محددة تنظم translationally ولكن أيضا يعطي معلومات مرنا محددة في قرار كودون مثل الاحتلال الدقيق وكثافة ريبوسوم على طول النص المحدد. وهذا هو على وجه الخصوص من اهتمام لمن mRNAs مع وسائل محددة مثل الترجمة من mRNAs IRES-إيواء، لأنها يمكن أن تعطي المزيد من المعلومات حول مكان على نسخة الريبوسوم التوظيف يحدث.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
| Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
| Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
| Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
| WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
| Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14×89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
| Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
| Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
| Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
| MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
| Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
| Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
| RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |
Riferimenti
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
- Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).
- Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5’TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).
- Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).
- Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115 (6), 739-750 (2003).
- Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).
- Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9 (3), (2013).
- Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).
- Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14 (11), (2013).
- Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).
- Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).
- Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5′ UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).
- Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).
- Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. High-throughput polyribosome fractionation. Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
