Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu
Summary
Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.
Abstract
canlı hücrelerin bağlamında protein etkileşimleri çalışma lokalizasyonu, dinamikleri ve etkileşim ortakları hakkında kritik bilgiler üretebilir. Bu bilgiler, evsahibi-patojen etkileşimlerinin bağlamında özellikle değerlidir. Birçok patojen proteinleri, hücre içi bir ortam içinde konak bağışıklık sistemi ve hayatta kalma kaçırma sağlayan, bu gibi bir şekilde çeşitli konak hücreleri içinde çalışır. Bu patojenin protein konukçu hücre etkileşimini incelemek için çeşitli yaklaşımlar sık dahil olmak üzere kullanılır: in vivo enfeksiyon transfeksiyon ya da transdüksiyon ile etiketli veya mutant protein ya da patojen genlerin katılması eksprese eden bir suşu ile. Bu yaklaşımların her biri avantajları ve dezavantajları vardır. Bu direkt olarak hücrelere ekzojen proteinleri katılması için bir araç çalıştı. Elektroporasyon yaygın hücrelere nükleik asitlerin dahil edilmesi için kullanılabilir, ancak biyo-fiziksel temeli tam olarak aynı olmasına rağmen daha nadir proteinlere uygulanmıştır.Standart bir Electroporator memeli hücrelerine afinite etiketli bakteriyel efektör tatbik etmek için kullanılmıştır. İnsan epiteliyal ve fare makrofaj hücreleri, geleneksel metodlarla kültürlenmek sureti ile ayrılır ve ilgi dahilindeki bir eksojen bakteriyel patojenin proteini (örneğin, Salmonella Typhimurium GtgE) ile 0.4 cm boşluk elektroporasyon küvetler içine yerleştirilmiştir. Elektroporasyon (0.3 kV) ve kısa (4 saat) geri kazanım süresinden sonra, hücre içi protein, flüoresan olarak afinite etiketi ile protein etiketleme ve konfokal mikroskopi ile mekansal ve zamansal dağılımının incelenmesi ile doğrulanmıştır. Elektroporasyona protein aynı zamanda hücre içinde işlevsel ve doğru hücre içi ticareti ve protein-protein etkileşimi yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir. Ekzojen proteinler hücrelerin yüzeyi üzerinde birikme eğiliminde iken, elektroporasyona örnekler sadece kuluçkalama için hücre içi efektör konsantrasyonda büyük artışlar vardı. protokol ap yapılacak basit ve yeterince hızlıhücre içi hedefleme ve hastalık oluşturma proteinlerin işlevine de dahil olmak üzere, konakçı hücrelerde patojen proteinlerinin yüksek verimli bir karakterizasyon için izin arallel moda.
Introduction
Bir çok Gram-negatif bakteriler, doğrudan konakçı hücreler 1-5 içerisine (efektör olarak anılacaktır) hastalık oluşturma ilişkili proteinler enjekte özel salgılama sistemleri kullanılmaktadır. Ev sahibi dokunulmazlık baskılanması, hücre iskeleti değişiklikler, hücre içi ticareti ve sinyalizasyon, transkripsiyon değişikliklerin modifikasyonu ve ev sahibi proteasome değişiklikler 6-9: Bu efektörleri dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonları geniş bir yelpazesi var. Bazı efektörlerinin işlevleri ancak ev sahibi hedefleri ve diğerleri biyokimyasal eylem (ler) belirlenecek kalır bilinmektedir. Vahşi tip ve yeniden birleştirici bakteriyel enfeksiyonların karşılaştırılması hücre içi efektör hastalık oluşturma mekanizmaları incelemek için geçerli bir yaklaşım olsa da, konakçı hücre içerisine bağımsız bir efektör tanıtmak için sıklıkla yararlıdır. Böylece, konakçı hücreler bağlamında bakteriyel efektör proteinler katma ve karakterize edilmesi için basit bir yöntem arzu edilmektedir.
Deneysel analiz wi BasitleştirmeTek bir efektör kritik inci diğer efektörler karşı ya da gereksiz işlevlere sahip olabilir. Bu basitleştirme gerçekleştirmek için, araştırmacılar, daha önce kazıma 12,13 yükleme viral transdüksiyon 10, mikroenjeksiyon 11 de dahil olmak üzere birçok farklı yöntemler ile hücrelere makromolekülleri getirmiştir, kimyasal olarak teşvik mikroenjeksiyon 14, özel bir protein "transfeksiyon", reaktif 15, kalsiyum fosfat çöktürme ile hücre füzyonu 16 ve elektroporasyon 17-20. kişiye moleküller, hücre içi hedefleri 21,22 protein, hücre-geçirgen olmayan boyalar ve antikorlar, DNA, RNA ve RNAi türler dahil olmak üzere nükleik asitler arasında değişir. Bazı yöntemler dahil edilebilir makromolekül Çeşidi dahil kısıtlamaları vardır ve özellikle alt-analizler, yüksek hücresel toksisite, etki zarar mekanizmaları, düşük etkililik ve giriş verimliliği ile sınırlı olabilir. Transfeksiyon, bir ofteaynı zamanda makrofajlar ve birincil hücre gibi uygun bir ev sahibi hücre tipi, transfeksiyon karşı özellikle dirençlidir sınırlama uğrar, memeli hücrelerinde bakteri genleri ifade etmek için bir yöntem, n-kullanılmıştır. Bunun ötesinde, yabancı DNA'nın sokulması üzerine üretilen bakteriyel protein seviyelerini kontrol etmek zordur.
Çok iş bilinen bir laboratuvar tekniği olarak bakteriyel ve memeli yaratıkların hücrelerine nükleik asit elektroporasyon kurdu; Bununla birlikte, fizyolojik koşullar altında, hücre içine proteinlerin verilmesi için en iyi yöntem devam etmekte olan bir araştırma vardır. Protein transfeksiyon üzerindeki raporlar umut vericidir, ama pahalı reaktifler ve optimizasyon gerektirir. minimum maliyet ile hücre hedefleri çeşitli içine potansiyel toksik bakteri efektörler tanıtmak arzusu in vivo bu proteinleri eğitim için bir yöntem olarak elektroporasyon dikkate götürdü.
Protein elektroporasyon 23-25 bir araya geldi iseAyrıca elektro-transfeksiyon veya elektro-enjeksiyon 26 olarak bilinen electropermeabilization üzerinden canlı hücreler içine proteinleri tanıtmak hod. Bu teknik, hücre zarlarında gözenekleri oluşturmak için yüksek yoğunluklu elektrik darbeleri kullanır. Bu geri dönüşümlü gözenekler normal hücre içi alandan dışlanan makromoleküllerin hücreye girmesine izin. Dış elektrik alanının çıkarılması üzerine, zar, hücre gözenekler 27,28 geçirilir molekülleri korumak için izin kapatın olabilir.
Standart bir Electroporator sürekli fare makrofaj-benzeri hücreleri ve insan epitel hücreleri hem de içine bakteri efektör tanıtmak için bu çalışmada kullanılmıştır. yöntem hücresel canlılığı hiçbir kayda değer azalma ile, hızlı, verimli ve ucuz. kişiye proteinler immünofloresan mikroskopi ile görüntülenmiştir veya fonksiyonel deneyleri için de kullanılabilir. Bu aynı zamanda, bir toksik-olmayan, standart olarak yeşil floresan proteini (GFP) ile gösterilmiştirİki Salmonella efektör proteinler, SspH1 ve GtgE. Bu ökaryotik konakçı hücrelerde bu bakteriyel hastalık oluşturma proteinleri ve işlevlerin çalışması için repertuarında ek bir araç olarak, protein elektroporasyon önerilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Patojen bakterilerin salgılanan efektörleri konak hücre ortamında çalışabilmesi için geliştiğini ve böylece konak içinde in situ bunları incelemek yararlı olacaktır. Konakçı hücrelere özel ilgi efektörlerinin giriş ilgili patojen-konakçı etkileşimleri bakteriyel proteinlerden müdahalesi olmaksızın tek başına ele sağlar. amaç, böylece transfeksiyon ya da transdüksiyon ile bağlantılı bazı zorluklar kaçınarak ökaryotik konakçı hücrelere bakteriyel efektör proteinler kat?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.
Materials
| Material or Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus – Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
Riferimenti
- Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
- Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
- Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
- Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
- He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
- Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
- Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
- Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
- Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
- Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
- Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
- Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
- Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
- Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
- Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
- Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
- Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
- Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
- Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
- McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
- Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
- Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
- Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
- Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino … [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
- Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan … [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).
