Todo el montaje de etiquetado de los cilios en el sistema olfativo principal de ratones
Summary
Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.
Abstract
The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.
Introduction
El epitelio olfatorio del ratón en la cavidad nasal comprende 6-10000000 bipolares neuronas sensoriales olfativas 1. Cada neurona olfativa elige una de 1.200 genes de receptores odoríferos para la expresión. Detección de los odorantes comienza por la unión a un receptor olfativo 2, que entonces activa la adenilato ciclasa de tipo III (ACIII) 3 a través de la proteína G específica olfativa Ga olf 4 odorante. El consiguiente aumento de la adenosina monofosfato cíclico (cAMP) abre un nucleótido cíclico-cerrada (GNC), canal catiónico no selectivo que conduce a afluencia de Ca 2+ y Na +, y, posteriormente, Ca 2 + afluencia conduce a la apertura de un Cl Ca 2+ activado – canal de 5,6. El resultante hacia afuera Cl – flujo es facilitado por un alto Cl intracelular – concentración constante mantenida por Cl – absorción, probablemente a través de la Na + / K + / Cl – NKCC1 cotransportador, laCl – / HCO 3 – SLC4A1 intercambiador, y tal vez los transportistas adicionales aún por identificar 6-8.
Neuronas olfativas bipolares tienen axones individuales, no ramificados que se proyectan directamente al bulbo olfatorio, y una dendrita que se extiende a la superficie del epitelio y termina como un compartimento especializado, el mando dendríticas. De este mando, 10-30 cilios, que puede alcanzar una longitud de hasta 50-60 micras, emanar en el moco que cubre la superficie epitelial 9. Las proteínas de la cascada de transducción de señal canónica se localizan principalmente en la membrana de estas cilios. El aumento de la superficie del epitelio sensorial amplifica la capacidad de detectar olores. Debido a la densidad de las neuronas sensoriales, cilios que se extiende desde las perillas dendríticas vecinos se entremezclan. Esta interrelación resultados en una mezcla aleatoria de los cilios de diferentes neuronas, que expresan diferentes tipos de receptores olfativos, en la superficie del epitelio. La detección y la célulaular asignación de las proteínas ciliares que sólo están presentes en un subconjunto de neuronas sensoriales tanto, es difícil en criosecciones. Además, la localización precisa de dichas proteínas a lo largo de los cilios es apenas posible, ya que cryosections son típicamente más delgada que la longitud media de los cilios.
Para permitir la investigación de ciliar localización de las proteínas de membrana hasta ahora no caracterizados en las neuronas olfativas, hemos optimizado una técnica de preparación de la cara en la que permite el análisis detallado de la localización de proteínas en los cilios. En pocas palabras, se sacrifica el ratón y la cabeza dividió cerca de la línea media. Los cornetes, nasal, y los huesos frontales se retiran para exponer el tabique. El tabique con la parte olfativa del epitelio de revestimiento se afloja mediante la reducción de todas las conexiones a la cavidad nasal. Después de poner el tabique en una placa de Petri llena con solución de Ringer, el epitelio se despega und transferido a un portaobjetos de vidrio recubierto. Tras una breve fixatpaso de iones, procedimientos inmunotinción se puede realizar si la manipulación es tan suave como sea posible para evitar el daño del tejido frágil. Se demuestra la resolución alcanzable mediante la comparación de la tinción de dos proteínas de membrana diferentes en cilios olfatorios en cryosections clásicos y en la preparación cara es descrito.
Protocol
Representative Results
Discussion
The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (Exc257, SFB958).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
Riferimenti
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