كله جبل وصفها من سيليا في النظام الشمية الرئيسية من الفئران
Summary
Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.
Abstract
The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.
Introduction
وتضم الظهارة الشمية الماوس في تجويف الأنف 6-10٬000٬000 القطبين الخلايا العصبية الحسية الشمية 1. كل عصبون حاسة الشم تختار واحدة من 1،200 جينات مستقبلات الرائحة للتعبير. كشف عطور يبدأ من الرائحة ملزمة لمستقبلات حاسة الشم 2، والذي ينشط ثم أدينيليل محلقة النوع الثالث (ACIII) 3 عن طريق حاسة الشم بروتين معين G Gα جبهة تحرير أورومو 4. ارتفاع الناتج في دوري أحادي فسفات (المخيم) يفتح دوري 2+ تدفق يؤدي (CNG)، قناة الموجبة غير الانتقائية التي تؤدي إلى تدفق الكالسيوم والصوديوم + 2+، وبعد ذلك الكالسيوم بوابات النوكليوتيدات لافتتاح الكلور الكالسيوم 2+ تفعيلها – قناة 5،6. ومما يسهل تدفق من قبل الخلايا الكلور عالية – – مما أدى الكلور الخارج والحفاظ على تركيز ثابت من الكلور – امتصاص، من المحتمل عن طريق نا + / K + / CL – NKCC1 cotransporter، وCL – / HCO3 – مبادل SLC4A1، والناقلين ربما إضافية بعد الكشف عن هويته 6-8.
الخلايا العصبية الشمية القطبين لها واحدة، محاور عصبية غير متفرع أن المشروع مباشرة إلى البصلة الشمية، والتغصنات أن تمتد إلى سطح البشرة وينتهي كما حجرة المتخصصة، ومقبض الباب شجيري. من هذا مقبض الباب، 10-30 أهداب، والتي يمكن أن تصل إلى طول يصل إلى 50-60 ميكرون، تنبثق في المخاط الذي يغطي سطح الظهارية 9. يتم ترجمة البروتينات من الكنسي نقل الإشارة التعاقبي أساسا في غشاء من هذه الأهداب. زيادة السطح الحسي للظهارة تضخيم القدرة على كشف عطور. نظرا لكثافة الخلايا العصبية الحسية، أهداب تمتد من المقابض شجيري المجاورة تختلط. هذا الاختلاط النتائج في خليط عشوائي من أهداب من الخلايا العصبية المختلفة، معربا عن أنواع مختلفة من المستقبلات الشمية، على سطح ظهارة. كشف وخليةتخصيص الجزيئية للبروتينات الهدبية التي هي موجودة فقط في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية غير ذلك من الصعب في cryosections. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التعريب الدقيق لهذه البروتينات على طول الأهداب هو بالكاد ممكنا، منذ cryosections وعادة ما تكون أرق من متوسط طول الأهداب.
لتمكين التحقيق في الهدبية توطين بروتينات الغشاء حتى uncharacterized بكثير في الخلايا العصبية الشمية، ونحن الأمثل لمواجهة أون تقنية إعداد والذي يسمح للتحليل مفصل للبروتين التعريب في أهداب. لفترة وجيزة، وضحى الماوس وتقسيم الرأس بالقرب من خط الوسط. تتم إزالة القرائن، والأنف، وعظام الأمامية لفضح الحاجز. وخففت الحاجز مع الجزء حاسة الشم من ظهارة بطانة عن طريق قطع كافة الاتصالات إلى تجويف الأنف. بعد وضع الحاجز في طبق بتري مليئة حل رينغر، ومقشر ظهارة قبالة اوند نقلها إلى شريحة الزجاج المطلي. بعد fixat قصيرةأيون خطوة والإجراءات المناعية يمكن أن يؤديها إذا المناولة هو لطيف ممكن لتجنب الضرر من الأنسجة الهشة. ونحن لشرح قرار تحقيقه من خلال مقارنة تلطيخ من اثنين من البروتينات الغشاء مختلفة في أهداب الشم في cryosections الكلاسيكية وفي إعداد أون الوجه وصفها.
Protocol
Representative Results
Discussion
The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (Exc257, SFB958).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
Riferimenti
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P. Ultrastructural aspects of olfactory signaling. Chemical Senses. 22 (3), 295-311 (1997).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
