Questo protocollo descrive le tecniche per l'isolamento di cellule vive e la coltura primaria di linee cellulari miogeniche e fibroblastiche da tessuto muscolare o cutaneo. Viene anche descritta una tecnica per l'immortalizzazione di queste linee cellulari. Nel complesso, questi protocolli forniscono uno strumento affidabile per generare e conservare cellule derivate da pazienti per applicazioni a valle.
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Articolo metodologico
Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling
In questo articolo
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Sommario
Abstract
La generazione di linee cellulari specifiche per il paziente rappresenta uno strumento inestimabile per la ricerca diagnostica o traslazionale, e queste cellule possono essere raccolte dal tessuto bioptico cutaneo o muscolare disponibile durante l'iter diagnostico del paziente. In questo protocollo, descriviamo una tecnica per l'isolamento di cellule vive da piccole quantità di tessuto muscolare o cutaneo per la coltura cellulare primaria. Inoltre, forniamo una tecnica per l'immortalizzazione di linee cellulari miogeniche e linee cellulari di fibroblasti da cellule primarie. Una volta immortalizzate le linee cellulari, è possibile ottenere una sostanziale espansione delle cellule derivate dai pazienti. Le cellule immortalizzate sono suscettibili di molte applicazioni a valle, tra cui lo screening farmacologico e la correzione in vitro della mutazione genetica. Nel complesso, questi protocolli forniscono uno strumento affidabile per generare e conservare cellule derivate da pazienti per applicazioni a valle.
Introduzione
La diagnostica molecolare si è evoluta notevolmente negli ultimi 20 anni. Il DNA genomico viene ora isolato di routine dall'espettorato o dal tampone della guancia, mentre in passato richiedeva un prelievo di sangue. Con gli attuali tempi di consegna rapidi e la facilità di sequenziamento genico, molte mutazioni della malattia vengono identificate di routine senza bisogno di ulteriori test. Nel caso della diagnostica delle malattie muscolari, l'identificazione di dozzine di nuovi geni nell'ultimo decennio responsabili della distrofia muscolare o della miopatia ha cambiato radicalmente il modo in cui queste malattie vengono diagnosticate 1,2. Attualmente....
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Protocollo
NOTA: I protocolli per la raccolta di tessuti umani devono essere esaminati e approvati dal comitato istituzionale IRB. Raccolta di scartati, tessuti umani de-identificato è stato approvato dal Children Hospital di Boston e Brigham and Women Hospital IRB Comitati. I metodi descritti di seguito sono stati applicati per l'isolamento di cellule miogeniche da de-identificati, scartato il tessuto. I metodi descritti sono applicabili ai tessuti raccolti da materiale paziente acconsentito.
Isolamento 1. Cella
- La dissociazione della biopsia muscolare e purificazione di cellule miogeniche
- Pre-pesare un tessuto piastra di co....
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Risultati
Figura 1 illustra alcuni dei passaggi chiave coinvolti nella dissociazione tessuti primaria: l'esatta quantità di tessuto è pesato in un piatto di coltura di tessuti petri sterile (Figura 1A, B). Il tessuto viene quindi macinato finemente usando bisturi sterile, fino ad ottenere uno slurry di tessuto (Figura 1C, D). Dopo l'aggiunta di enzimi digestivi, il muscolo principale dissociazione del tessuto avviene normalmente tramite digestione enzimatica entro 45-90 m.......
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Discussione
Le cellule come una risorsa utile
L'isolamento e la cultura delle popolazioni di cellule miogeniche è estremamente utile quando si stabilisce fenotipi di malattia o in modelli in vitro di malattia. La procedura di isolamento delle cellule miogeniche qui descritto consente l'isolamento di mioblasti e fibroblasti da campioni del muscolo scheletrico, che possono poi essere propagate, differenziati, o immediatamente analizzati. La struttura e la funzione dei mioblasti p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa pubblicazione è finanziata attraverso Cure CMD, una sovvenzione dell'Association Contre Les Myopathies (AFM) (progetto 16297), e dal National Institutes of Health (numeri di sovvenzione K08 AR059750, L40 AR057721 e 2R01NS047727).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Attrezzature | |||
| Tissue cappa di biosicurezza per coltura | Baker Company, Inc. | Modello SterilGuard Hood | |
| Centrifuga da banco, come il modello Beckman | Beckman Coulter | Modello Allegra 6R | Se viene eseguita la selezione cellulare, è preferibile una centrifuga con refrigerazione |
| Microscopio | Nikon | Modello Eclipse TS100 | |
| Incubatore per colture tissutali, collegato a una fonte CO2 Forma | Scientific | Serie II | |
| Selezionatore cellulare attivato da fluorescenza (FACS) | Becton Dickinson | Model Aria | |
| Reagenti per l'isolamento di mioblasti primari dal tessuto | |||
| Dispase II | Roche Applied Science | #04942078001 | Preparare una soluzione di calza di 2,4U/ml in DMEM |
| Collagenasi D | Roche Applied Science | #088882001 | Preparare una soluzione madre da 10 mg/ml |
| 1x Hank' sterile s Soluzione salina bilanciata (HBSS), priva di calcio e magnesio | GIBCO Life Technologies | #14185-052 | |
| Albumina sierica bovina, frazione V | Sigma | #05470 | Preparare una soluzione sterile di 1X HBSS 0,5% BSA per la selezione FACS |
| Terreno di crescita sterile per mioblasti: Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio (4,5 g) integrato con il 30% di siero fetale bovino | GIBCO Life Technologies | 11965-092 | Contiene L-glutammina |
| Soluzione di lisi RBC | Qiagen | 158904 | |
| Ioduro di propidio 10mg/ml | Sigma | P4170 | Preparare la soluzione madre diluendo la polvere in acqua distillata sterile |
| Anticorpo CD56 umano per citometria a flusso | Biolegend | 318310 | Anticorpo coniugato APC, sono disponibili altre etichette |
| Reagenti per l'immortalizzazione dei mioblasti | |||
| Linea cellulare di imballaggio ecotropico PE | Cell Biolabs | RV-101 | |
| Linea cellulare di confezionamento anfotropico PA3174 | Cell Biolabs | RV-102 | |
| Gelatina di pelle di maiale | Sigma | G1890-500g | Preparare una soluzione madre di gelatina allo 0,1% in acqua. Rivestire il piatto con la soluzione a 37 gradi C per un'ora. Rimuovere la soluzione e aggiungere il terreno. |
| PolyJet | Signagen | SL100688 | |
| G418 | Fisher | 345812 | |
| Hygromycin | EMD Biosciences | 400051 | |
| plasmidi pBabe contenenti mCDK4 e hTERT | non disponibili | Stadler et al, 2013 | |
| Kit midiprep del plasmide Qiagen | Qiagen | 12143 | |
| Medium 199 | Life Technologies | Medio 199 (31150022) | |
| Dulbecco' s Eagle medium modificato (DMEM) | Life Technologies | DMEM (11965-092) | Mix 4:1 DMEM:199 |
| Terreno di crescita mioblasto: 4:1 Dulbecco' s modificato Eagle medium (DMEM) e Medium 199 integrato con il 15% di siero fetale bovino; tampone HEPES da 0,02 M; 1,4 mg/L di vitamina B12; 0,03 mg/L di ZnSO4, 0,055 mg/L di desametasone, 2,5 μ g/L fattore di crescita degli epatociti e 10 μ g/L di fattore di crescita dei fibroblasti beta. | Tecnologie per la vita (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (solfato di zinco); Sigma (Vit.B12, Desametasone); Chemicon internazionale (HGF); Biopioniere (betaFGF) | #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF). | Preparare il terreno e la soluzione madre Vit. B12 (20mg/ml); Solfato di zinco (60µ g/ml); Dex (55µ g/µ l) separatamente per un uso più semplice. Soluzione madre di HGF (5µ g/ml) e FGF (20µ g/ml) deve essere aggiunto fresco ogni settimana alla concentrazione di lavoro finale. |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 | |
| Anticorpo a catena pesante della miosina per l'immunocolorazione | Banca degli ibridomi dello sviluppo | MF20 | Clone MF20 |
| Desmin Anticorpo per l'immunocolorazione | Thermo Scientific | MS-376-S0 | Clone D33 |
| Siero di cavallo | Invitrogen | 26050-088 | |
| Reagenti per l'isolamento dei fibroblasti cutanei primari | |||
| Terreno di trasporto: RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino e lo 0,2% di penicillina/streptomicina | Terreno RPMI 1640: GIBCO Life Technologies | 11875-093 | |
| Terreno di coltura di fibroblasti primari umani: RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina | Siero fetale bovino: Thermo Scientific | SH30071.03 | |
| Soluzione di collagenasi: Collagenasi di tipo 2 (100 mg) risospesa in 12,5 ml di terreno di coltura per fibroblasti e sterilizzata con filtro | Worthington | 4176 | |
| Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) senza calcio e magnesio | Lonza | 17-516F | |
| Materiali per l'isolamento dei mioblasti | |||
| primari Provette coniche sterili da 50 ml e 15 ml | GeneMate/Bioexpress | C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml)) | |
| Bisturi sterili | Aspen Surgical | 372610 | |
| Emocitometro | Hausser Scientific | 1492 | |
| Pipette sterili da 5, 10 e 25 ml Vetro | Bellco | 1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml) | Le pipette riutilizzabili vengono lavate, tappate con cotone e sterilizzate in autoclave prima dell'uso |
| Piastre in plastica sterili trattate con coltura tissutale (10 cm) | BD Falcon | 353003 | |
| Filtri cellulari sterili in nylon (100 &; micro; m e 40 µ taglia m) | BD Falcon | 352340 (40µ m); 352360 (100µ m) | |
| Materiali per l'immortalizzazione dei mioblasti | |||
| Sterile 0,45 & micro; m filtri | Millipore | SLHV013SL | |
| Anelli di clonazione | Corning | #3166-8 | Da pulire e sterilizzare in autoclave prima e dopo l'uso |
| Materiali per linee cellulari di fibroblasti | |||
| Piastre sterili in plastica trattate per colture tissutali da 35 mm | Greiner bio-one | 628160 | |
| Bisturi sterili | DeRoyal | D4510A | |
| Flaconi sterili per colture tissutali T25 | Techno Plastic Product, TPP | 90026 | venduti negli Stati Uniti da MIDSCI |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 |
Riferimenti
- Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
- Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
- Sharples, A. P., Stewart, C. E.
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.
A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette
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