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Biologia

Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de l'utilisation des Métazoaires organisme modèle<em> C. elegans</em

Published: January 08, 2015
doi:
10.3791/52321
, , , ,
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research,Northwestern University

Summary

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Abstract

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Introduction

Beaucoup de maladies neurodégénératives, dont la maladie d'Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (PD), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), et les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST), sont associés à des protéines d'agrégation sujette et sont donc collectivement connus comme mauvais repliement des protéines troubles (PMD ). EST ou maladies à prions constituent une classe unique de PMD en ce qu'ils peuvent être infectieux chez les humains et les animaux 1. Au niveau moléculaire, les prions répliquent par le recrutement et la conversion de monomère α-hélice riche PrP cellulaire codée par l'hôte (PrP C) dans le pathologique β-feuille riche PrP Sc conformation 2,3. agrégats auto-propagation protéines ont également été identifiés dans les champignons, qui partagent des caractéristiques importantes des prions de mammifères 4,5. En outre, les prions de mammifères sont capables de se déplacer de cellule à cellule et infectent les cellules naïves 6,7.

Alors que PMD OTHer que les EST ne sont pas infectieux, ils partagent un principe pathogène commun avec les maladies à prions 8,9. Bien que les protéines liées à chacun des PMD ne sont pas liés dans la structure ou la fonction, ils tous les agrégats de formulaire via un processus de cristallisation comme appelés nucléé ou la polymérisation ensemencées; ailleurs semences protéiques grandir en recrutant leurs isoformes solubles 2,10,11. L'efficacité de l'auto-propagation in vivo varie, en fonction des propriétés intrinsèques de la protéine, qui, avec d'autres facteurs cellulaires tels que les chaperons moléculaires finalement déterminer les taux de nucléation agrégat, l'ensemencement, la fragmentation et la diffusion de 12 à 15. Par conséquent, il doit exister un juste équilibre entre ces facteurs qui permet la propagation efficace de l'agrégation des protéines. Cela pourrait aussi expliquer pourquoi seuls certains agrégats amyloïdogéniques abritent les caractéristiques d'un prion, et donc tous les PMD sont infectieux. Prions semblent représenter l'o 'top-interprètesfa large éventail d'agrégats protéiques auto-réplication, qui en fait un outil puissant pour étudier PMD 8,13.

Curieusement, la toxicité associée aux agrégats liés à la maladie a souvent un composant non cellulaire autonome 16,17. Cela signifie qu'ils affectent des cellules voisines qui ne expriment pas le gène correspondant, par opposition à un effet strictement cellule autonome, ce qui implique que seules les cellules exprimant le gène présentent le phénotype spécifique. Cela a été démontré de façon convaincante par l'expression spécifique d'un tissu ou d'abattre les protéines respectives dans de nombreux modèles de maladies neurodégénératives 18-26. Divers mécanismes ont été suggérés comme une base pour cette toxicité autonome non-cellule dans les PMD, y compris l'approvisionnement en éléments nutritifs diminué, déséquilibre dans la signalisation neuronale, excitotoxicité du glutamate et neuroinflammation 16,27,28. En outre, un mouvement de prion comme des agrégats de maladies liées entre cellules MIGHt contribuer à cet aspect 29,30. Des preuves croissantes suggèrent que les protéines autres que les inclusions peuvent transmettre prions de cellule à cellule, ce qui peut expliquer la propagation de la caractéristique de la pathologie observée dans de nombreux PMD 30-36. Cependant, il n'a pas encore été déterminé se il existe un lien de causalité évident entre le mouvement intercellulaire de protéines de la maladie et l'effet toxique sur les cellules voisines. Par conséquent, une meilleure compréhension des voies cellulaires qui sous-tendent la transmission de cellule à cellule et la toxicité cellulaire non autonome est nécessaire et essentiel pour le développement de nouveaux produits thérapeutiques. Cependant, de nombreux aspects de prion-like facteurs d'étalement et cellulaires qui influencent la transmission des protéines mal repliées de cellule à cellule dans métazoaires ne sont pas bien comprises, en particulier au niveau de organismal.

Le nématode Caenorhabditis elegans a plusieurs avantages qui fournissent le potentiel de découvrir de nouvelles facettes de prion-like spreading chez les métazoaires 17. Il est transparent, ce qui permet le suivi in vivo de protéines par fluorescence marqués dans l'organisme vivant. En outre, de nombreux processus cellulaires et physiologiques touchées par la maladie sont conservés des vers pour la santé humaine, et C. elegans est également prête à une grande variété de manipulations génétiques et les analyses moléculaires et biochimiques de 37 à 39. Exactement 959 cellules somatiques constituent l'hermaphrodite adulte avec un plan de corps simple qui a encore plusieurs types de tissus distincts, y compris musculaires, les neurones et l'intestin.

Pour établir un nouveau modèle de prion en C. elegans, nous avons choisi d'exprimer la glutamine exogène / asparagine bien caractérisés (Q / N) riche prion domaine NM de la protéine cytosolique levure prion Sup35, car il n'y a pas de protéines prions endogènes connus vers 4,40. prions de levure ont été inestimables pour élucider les mécanismes de base de la réplication du prion 41-44. En outre, NM est le sapinst cytosolique protéine prion-like qui a été montré pour récapituler le cycle de vie complet d'un prion dans la culture de cellules de mammifères 45,46. De même, lorsqu'il est exprimé dans C. elegans, le domaine de prion Sup35 adoptée remarquablement bien aux différentes exigences pour la propagation dans les cellules de métazoaires par rapport à des cellules de levure et les principales caractéristiques exposées de la biologie du prion agrégation 40. NM a été associée à un phénotype toxique profonde, y compris la perturbation de l'intégrité mitochondriale et l'apparence de diverses vésicules autophagie liés au niveau cellulaire, ainsi que l'arrestation embryonnaire et larvaire, retard de développement, et une perturbation généralisée de l'environnement de repliement des protéines au niveau de organismal. Étonnamment, le domaine de prion cellulaire présente une toxicité cellulaire autonome et non autonome, affectant les tissus avoisinants, dans lequel le transgène ne est pas exprimé. En outre, le transport vésiculaire du domaine des prions dans et entre les cellules est surveillée en temps réel <em> in vivo 40.

Nous décrivons ici comment examiner prion-like diffusion en C. elegans. Nous allons vous expliquer comment surveiller le transport intra et intercellulaire de vésicules contenant le domaine de prion utilisant time-lapse microscopie à fluorescence. Nous mettrons l'accent sur l'utilisation de capteurs de pliage tissu-spécifiques et exprimée de manière ubiquitaire journalistes de stress pour évaluer les effets cellulaires autonomes cellules autonomes et non sur la forme physique cellulaire. Enfin, nous allons décrire la procédure d'un écran récemment effectué du génome grande interférence ARN (ARNi) pour identifier de nouveaux modificateurs de la toxicité induite par le prion. En combinaison, ces méthodes peuvent aider à démêler les voies génétiques impliquées dans le mouvement intercellulaire de protéines et de leur toxicité autonome non cellulaire.

Protocol

1. Surveillance transcellulaire épandage des protéines à prions comme par In Vivo imagerie time-lapse NOTE: Cultivez C. elegans de type sauvage (WT) (N2) et lignées transgéniques selon des méthodes standard et de contrôler attentivement la température de la culture 47. Générer des lignées transgéniques de C. elegans exprimant la protéine prion-like, marqués avec la protéine fluorescente rouge monomère (RDRF). Regardez cette vid…

Representative Results

Suivi intercellulaire propagation de protéines prion-like in vivo par imagerie time-lapse Transgénique C. elegans lignes exprimant le domaine des prions sont particulièrement bien adaptées pour l'analyse de certains aspects de protéines prions en forme, par exemple, la transmission de cellule à cellule et la toxicité non autonome cellulaire. La transparence des animaux permet un suivi de fluorescence protéines marquées au sein de l&#39…

Discussion

Les procédés décrits ici permettent d'illustrer la propagation cellulaire et la toxicité de la cellule autonome et non autonome complexe de protéines prion-like. Nous avons récemment découvert que un domaine prion cytosolique agrégation sujette est repris dans des vésicules membranaires dans un processus d'autophagie liés. Un sous-ensemble spécifique de ces vésicules transporte le domaine de prion dans et entre les cellules et les tissus 40. La clé pour contrôler leur mouvement dans l&#3…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

Materials

Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains
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Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).
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