La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo<em> C. elegans</em
Summary
Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.
Abstract
Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.
Introduction
Muchas de las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), y las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET), se asocian con proteínas de agregación propensos y están, por tanto, colectivamente conocidos como proteínas misfolding trastornos (PMD ). EET o enfermedades priónicas constituyen una clase única de PMD en que pueden ser infecciosas en seres humanos y animales 1. A nivel molecular, los priones se replican mediante el reclutamiento y la conversión-rica α-hélice PrP celular codificada por el hospedador monomérico (PrP C) en el rico en β-hoja de PrP Sc conformación patológica 2,3. Agregados de proteínas autopropagante también se han identificado en los hongos, que comparten características importantes con priones mamíferos 4,5. Además, priones mamíferos son capaces de pasar de célula a célula e infectan células de los animales 6,7.
Mientras PMD other de EET no son infecciosas, comparten un principio patógena común con las enfermedades priónicas 8,9. Aunque las proteínas vinculadas a cada uno de los PMD no están relacionadas en estructura o función, que todos los agregados formulario a través de un proceso de cristalización como llaman nucleado o polimerización sembraron; Además semillas proteicas crecen mediante la contratación de sus isoformas solubles 2,10,11. La eficiencia a la auto-propagan in vivo varía, dependiendo de las propiedades intrínsecas de la proteína, que junto con factores celulares adicionales, tales como chaperones moleculares en última instancia determinan las tasas de nucleación agregada, la siembra, la fragmentación y la difusión de 12-15. Por lo tanto, debe existir un equilibrio entre estos factores que permiten la propagación eficiente de la agregación de proteínas. Esto también podría explicar por qué sólo algunos agregados amiloidogénicos albergan las características de un prión, y por lo tanto no todos los PMD son infecciosos. Los priones parecen representar o 'top artistas intérpretes o ejecutantesfa amplio espectro de agregados proteicos auto-replicantes, que los convierte en una poderosa herramienta para estudiar PMD 8,13.
Curiosamente, la toxicidad asociada con los agregados relacionados con la enfermedad tiene a menudo un componente autónomo no celular 16,17. Esto significa que afectan a las células vecinas que no expresan el gen correspondiente, en contraste con un efecto de célula autónoma estrictamente, lo que implica que sólo las células que expresan el gen de la exposición fenotipo específico. Esto fue convincentemente demostrado por la expresión específica de tejido o derribar las respectivas proteínas en numerosos modelos de enfermedades neurodegenerativas 18-26. Diversos mecanismos se han sugerido como una base para esta toxicidad autónoma no celular en PMD, incluyendo el suministro de nutrientes disminuido, el desequilibrio en la señalización neuronal, excitotoxicidad del glutamato, y la neuroinflamación 16,27,28. Además, un movimiento de priones como de agregados de enfermedades vinculadas entre las células Might contribuyen a este aspecto 29,30. La evidencia creciente sugiere que las inclusiones proteína distinta de priones pueden transmitir de célula a célula, lo que puede explicar la característica de propagación de la patología observado en muchos PMD 30-36. Sin embargo, aún no se ha determinado si existe una clara relación causal entre el movimiento intercelular de proteínas de la enfermedad y el efecto tóxico sobre las células vecinas. Por lo tanto, una mejor comprensión de las vías celulares que subyacen a la transmisión de célula a célula y la toxicidad celular autónomo no es necesario y esencial para el desarrollo de nuevas terapias. Sin embargo, muchos aspectos de priones como la difusión y celulares factores que influyen en la transmisión de célula a célula de proteínas mal plegadas en metazoos no se conocen bien, en particular a nivel del organismo.
El nematodo Caenorhabditis elegans tiene varias ventajas que ofrecen el potencial de descubrir nuevas facetas de priones como spreading en metazoos 17. Es transparente, lo que permite el seguimiento in vivo de las proteínas fluorescentemente marcadas en el organismo vivo. Además, muchos procesos celulares y fisiológicas afectadas por la enfermedad se conservan de gusanos para la salud humana, y C. elegans también es susceptible a una amplia variedad de manipulaciones genéticas y análisis moleculares y bioquímicos 37-39. Exactamente 959 células somáticas conforman el adulto hermafrodita con un plan de cuerpo simple que todavía tiene varios tipos de tejidos distintos, incluyendo los músculos, neuronas y delgado.
Para establecer un nuevo modelo de prión en C. elegans, se optó por expresar de forma exógena la glutamina / asparagina bien caracterizado (Q / N) ricos en priones dominio NM de la proteína priónica de levadura citosólica Sup35, ya que no hay proteínas priónicas endógenos conocidos gusanos 4,40. Los priones de levadura han sido invaluables en la aclaración de los mecanismos básicos de la replicación de priones 41-44. Además, Nuevo México es el abetocitosólica proteína prión como st que se ha demostrado para recapitular el ciclo de vida completo de un prión en cultivos celulares de mamíferos 45,46. Del mismo modo, cuando se expresa en C. elegans, el dominio prión Sup35 adoptado notablemente bien a los diferentes requisitos para la propagación en células de metazoos en comparación con células de levadura y de las características clave de la biología expuestas prión agregación 40. NM se asoció con una profunda fenotipo tóxicos, incluyendo la interrupción de la integridad mitocondrial y la apariencia de diversas vesículas autofagia relacionados en el nivel celular, así como la detención embrionario y larval, retraso del desarrollo, y una alteración generalizada del medio ambiente plegamiento de la proteína en el nivel del organismo. Sorprendentemente, el dominio prion celular exhibe toxicidad celular autónoma y no autónoma, que afecta a los tejidos vecinos en la que no se expresó el transgén. Además, el transporte vesicular del dominio prión dentro de y entre las células se monitoriza en tiempo real <em> in vivo 40.
Aquí se describe cómo examinar difusión-prión como en C. elegans. Vamos a explicar cómo supervisar el transporte intra e intercelular de vesículas que contienen el dominio de priones usando microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. Haremos hincapié en el uso de sensores de plegado específicos de tejido y de expresión ubicua reporteros de estrés para evaluar los teléfonos celulares efectos autónomas autónomas y no sobre la aptitud celular. Por último, vamos a describir el procedimiento de una pantalla recientemente realizado genoma amplia ARN de interferencia (RNAi) para identificar nuevos modificadores de la toxicidad inducida por priones. En combinación, estos métodos pueden ayudar a desmenuzar las vías genéticas implicadas en el movimiento intercelular de proteínas y su toxicidad autónoma no celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos descritos aquí ayudan a ilustrar la difusión y la toxicidad celular autónoma la célula compleja autónomos y no de las proteínas priones similares. Recientemente hemos descubierto que un dominio citosólico prión agregación propensos se recoge en vesículas de membrana en un proceso de autofagia relacionados. Un subconjunto específico de estas vesículas transporta el dominio prión dentro de y entre las células y los tejidos 40. La clave para controlar su movimiento en el animal vivo es…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).
Materials
| Reagent | |||
| Nanosphere size standards 100 nm | ThermoScientific | 3100A | |
| Levamisole | Sigma | L-9756 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| Ahringer RNAi library | Source BioScience LifeSciences | http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/ |
|
| Equipment | |||
| Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC | ThermoScientific | 75004521 | http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60 |
| 96 pin replicator | Scionomix | http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/ | |
| HiGro high-capacity, incubating shaker | Digilab | http://www.digilabglobal.com/higro | |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Titertrek | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm | |
| Biomek FX AP96 Automated Workstation | Beckman Coulter | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm | |
| Innova44 shaker | New Brunswick | http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&action=products&contentid=1& catalognode=83389 |
|
| M205 FA | Leica | http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/ | |
| ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera | Hamamatsu | http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html | |
| Spinning Disc AF Confocal Microscope | Leica | http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/ | |
| Falcon 4M60 camera | Teledyne Dalsa | http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/ | |
| Software | |||
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html | |
| Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software | Meyer Instruments | http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm | |
| ImageJ | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| wrMTrck plugin for ImageJ | http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html | ||
| C. elegans strains | |||
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570 | |
| AM815 rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] | Morimoto lab | available from our laboratory | |
| See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains |
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