Utarbeidelse og karakterisering av SDF-1α-Chitosan-dekstransulfat Nanopartikler

Summary

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.

Abstract

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

Introduction

Dextransulfat (DS) og kitosan (CS) er polysakkarider med flere erstattet negativt ladede sulfatgrupper (DS), eller positivt ladede amingrupper (deacetyleres CS). Når det blandes i en vandig løsning, de to polysakkaridene danner polyelektrolyttkomplekser gjennom elektrostatiske interaksjoner. De resulterende kompleksene kan dannes store aggregater som vil være fase-separert fra den vandige oppløsning (utfellinger), eller små partikler som er vanndispergerbar (kolloider). De spesifikke forholdene som bidrar til disse resultatene har blitt grundig studert, og er oppsummert og illustrert i detalj i en fersk gjennomgang ^1. Blant disse forholdene, er de motsatt ladede polymerer må 1) ha vesentlig forskjellig molmassefordeling to grunnleggende krav for å produsere vann dispergerbare partikler; og 2) blandes i et ikke-støkiometrisk forhold. Disse forholdene vil tillate ladningsnøytralt kompleks polymere segmenter generert av kostnadnøytralisering for å segregere og danne kjernen av partikkelen, og det overskytende polymer for å danne det ytre skallet ^1. Ved sukker partikler som er beskrevet i denne protokollen er ment for pulmonal levering, og er designet for å være netto negativt ladet, og av nanometer dimensjoner. Den negative overflateladning reduserer sannsynligheten for cellulært opptak av partiklene ^2,3. Partikler av nanometer dimensjon lette passasjen gjennom distale luftveiene. For å oppnå dette målet, er mengden av DS anvendes i dette preparatet i overkant av CS (vektforhold 3: 1); og med høy molekylvekt DS (vekt-gjennomsnittlig MW 500.000), og med lav molekylvekt CS (MW-området 50 til 190 kDa, 75-85% deacetylert) brukes.

SDF-1α er en stamcellemålsøkende faktor, som utøver den målsøkende funksjon gjennom sin kjemotaktiske aktivitet. SDF-1α spiller en viktig rolle i homing og vedlikehold av blodkreft stamceller i benmargen, og i rekruttering av progemonitoren celler til perifert vev for skade reparasjon ^4,5. SDF-1α har en heparin-bindingssete i dets proteinsekvensen, noe som gjør at proteinet binder seg til heparin / heparansulfat, danner dimerer, bli beskyttet mot protease (CD26 / DPPIV) inaktivering, og samhandle med målceller via celleoverflatereseptorene ^6-8. DS har lignende strukturelle egenskaper som heparin / heparansulfat; således binding av SDF-1α til DS vil være lik den i dens naturlige polymere ligander.

I den etterfølgende protokoll beskriver vi fremstilling av SDF-1α-DS-CS nanopartikler. Prosedyrene representerer en av de formuleringer som tidligere har blitt studert ^9. Protokollen er opprinnelig tilpasset fra en undersøkelse av VEGF-DS-CS nanopartikler ^10. En fremstilling i liten skala er beskrevet, som lett kan skaleres opp med de samme stamløsninger og fremstillingsbetingelser. Etter fremstilling blir partiklene karakterisert by undersøke deres størrelse, zeta potensial, omfanget av SDF-1α inkorporering, in vitro frigjøringstiden, og aktiviteten av det inkorporerte SDF-1α.

Protocol

1. Utarbeidelse av SDF-1α Glycan Nanopartikler På grunn av formålet med in vivo levering, sterilisere alle beholdere, pipetter og tips som brukes i utarbeidelsen. Forbered følgende stamløsninger i ultrarent vann: 1% dekstransulfat; 1 M NaOH (sterilfiltrert med en PES-membran); 0,1% kitosan i 0,2% iseddik (filter gjennom 0,8 og 0,22 um filter etter hverandre og juster pH til 5,5 med NaOH etterpå); 0,1 M ZnSO4; 15% mannitol; og 0,92 mg / ml SDF-1α (lagret …

Representative Results

Størrelsen og zeta-potensialet for de fremstilte SDF-1α-DS-CS partikler er bestemt med en partikkel analysator. Figur 1 viser analysen av størrelsesmåling. Fra cumulants resultatene oppnådd fra fire gjentatte målinger, er den gjennomsnittlige hydrodynamisk diameter for SDF-1α-DS-CS-partikler 661 ± 8.2 (nm), og polydispersiteten er 0,23 ± 0,02. Resultatet av zeta-potensialmåling, er vist i figur 2. Fra de fem gjentatte målinger, er zeta-potensialet av SDF-1α-DS-CS partikler -…

Discussion

Som nevnt ovenfor, er DS-CS nanopartikler dannet ved ladningsnøytralisering mellom polyanion (DS) og polykation (CS) molekyler. Siden ladningen interaksjon foregår lett under molekyl kollisjon, er konsentrasjonen av polymerløsninger og omrøringshastigheten under blanding avgjørende for størrelsen av de resulterende partikler. En generell trend er at mer utvannet DS og CS løsninger ¹⁵ og høyere rørehastigheten resultat i mindre partikler.

Formuleringen av SDF-1α glykan na…

Materials

Name	Company	Catalog number
Dextran sulfate	Fisher	BP1585-100
Chitosan, low molecular weight	Sigma	448869
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure water	Invitrogen	10977-023
SDF-1α	Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 um.	Millipore	SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm)	Fisher	14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain	Fisher	PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System	BioRad	170-8640
Corning Transwell Permeable Supports	Corning	3421
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Sigma	D8537
Pyrogent plus kit	Fisher	NC9753738