This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.
Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum – if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.
औषध विज्ञान के अनुशासन में 150 से अधिक वर्षों के लिए पृथक ऊतक स्नान प्रणाली का इस्तेमाल किया गया है। इस प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा ऐसे उच्च रक्तचाप, दिल की विफलता, मधुमेह, जठरांत्र रोग, मूत्राशय जैसे रोगों या विकारों के साथ व्यक्तियों के लाखों लोगों का इलाज किया है कि चिकित्सा के आधार बनाने के लिए इस ज्ञान के साथ, रिसेप्टर्स और रिसेप्टर संकेत पारगमन चिह्नित करने के लिए दुनिया भर के वैज्ञानिकों की अनुमति दी है रोग, अस्थमा, और निगल विकारों, बस कुछ ही नाम के लिए। यह ऊतक एक ऊतक के रूप में कार्य करने के लिए अनुमति देता है के रूप में इस दिन के लिए, पृथक ऊतक स्नान, दवा के विकास और बुनियादी अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण पहलू बनी हुई है। इस जौव पाठ में, एक औपचारिक प्रोटोकॉल रिसेप्टर लक्षण वर्णन परमिट जो isometric संकुचन उपाय है कि एक पृथक ऊतक स्नान प्रयोग से डेटा का उपयोग एक दृश्य और आभासी प्रयोग प्रदर्शित करने के लिए साझा किया जाता है।
इस तकनीक का प्राथमिक लाभ ऊतक एक रह रही है वह यह है किशरीर के लिए प्रासंगिक है कि एक शारीरिक परिणाम (संकुचन या विश्राम) के साथ एक पूरी ऊतक के रूप में एन डी काम करता है। यह कदम (दवा-रिसेप्टर बातचीत, संकेत पारगमन, दूसरा दूत पीढ़ी, चिकनी पेशी excitability के में बदलने के लिए, और ऊतक समारोह में परिवर्तन) के एक संश्लेषण है। अन्य तकनीकों के इन चरणों में से प्रत्येक के अध्ययन (जैसे radioligand दवा आत्मीयता, दूसरा दूतों की माप के लिए बाध्यकारी) की अनुमति, पृथक ऊतक स्नान तकनीक इन सभी चरणों एक के एकीकरण के लिए अनुमति देता है। एक और लाभ यह ऊतक समारोह को बनाए रखना एक सेलुलर सेटिंग बनाम एक ऊतक में अधिक सार्थक कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण औषधीय चर की गणना है कि परमिट है; यह जांच की दवाओं के एक पूरे के रूप में शरीर में कैसे काम करेगा के करीब आता है।
एक अनुसंधान उपकरण के रूप में Isometric बल के मापन 150 साल पुराना है, लेकिन यह सिकुड़ा ऊतकों 2 में रिसेप्टर लक्षण वर्णन के लिए आद्य तकनीक होना जारी है। इस तकनीक की शक्ति को अपनी सादगी और बहुमुखी प्रतिभा में है: एक विरोधी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एक agonist की सांद्रता में वृद्धि से हासिल की प्रतिक्रियाएं रिकॉर्डिंग से, जानकारी के असंख्य करने के लिए प्रत्येक दवा के औषधीय विशेषताओं और रिसेप्टर के बारे में प्राप्त किया जा सकता है, जो यह 3-5 बांधता है। इस प्रकार के प्रयोगों का भी इस्तेमाल किया विरोधी के गैर-प्रतिस्पर्धात्मक प्रकृति बनाम प्रतियोगी के बारे में जानकारी है, साथ ही रिसेप्टर विविधता और गैर विशिष्ट दवा प्रभाव 6-8 जुटाने। इस प्रकार, इस पृथक ऊतक स्नान प्रयोग करने के लिए सरल क्रमपरिवर्तन के साथ, एगोनिस्ट प्रेरित मांसपेशियों में संकुचन कि मध्यस्थता रिसेप्टर्स की एक अपेक्षाकृत पूरा औषधीय प्रोफाइल उत्पन्न किया जा सकता है।
Agonism के संदर्भ में, वेंएक दिया ऊतक में एक agonist के ई रिश्तेदार प्रभावकारिता (ई मैक्स) और शक्ति (ईसी 50) एक ही ऊतक 1 में अन्य एगोनिस्ट की प्रतिक्रियाओं की तुलना में गणना की जा सकती है। हमारे प्रयोग में चूहे वक्ष महाधमनी वाहन या पूर्व संकुचन ऊतक स्नान करने के लिए α 1 एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट phenylephrine जोड़ने और पैदा करने के लिए एक घंटे के लिए α 1 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर प्रतिपक्षी prazosin (5 एनएम) के साथ या तो incubated किया गया था। संशोधित परिणाम 2 प्रस्तुत चित्रा हरे रंग की प्रतिक्रियाएं मैक्स के रूप में चिह्नित पीई द्वारा हासिल की अधिकतम संकुचन के साथ चिह्नित किया गया है चित्रा 1 की।, साढ़े अधिकतम संकुचन जैसे चिह्नित और फिर प्रतिक्रिया है कि कारण है कि पीई एकाग्रता के साथ जुड़े। इन मूल्यों की पहचान करना एक आधा अधिकतम (50%) प्रतिक्रिया या चुनाव आयोग 50 मूल्य प्राप्त होता है कि एक agonist के प्रभावी एकाग्रता की पहचान है।
दुर्भाग्य से, एगोनिस्ट निर्भर पैरामीटर का उपयोगरिसेप्टर बाध्यकारी विशेषताओं 9 जटिल हो सकता है निर्धारित करने के लिए अकेला है। लगातार प्रतिपक्षी हदबंदी (पी बी) के -log 10 और दाढ़ प्रतिपक्षी के -log 10: आदर्श रूप में, रिसेप्टर विरोधी का उपयोग करते हुए अतिरिक्त प्रयोगों एक दवा और एक रिसेप्टर के बीच बातचीत को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि दो महत्वपूर्ण मापदंडों की गणना के लिए अनुमति देते हैं आवश्यक एकाग्रता एकाग्रता-प्रतिक्रिया की अवस्था में दो गुना दाहिनी ओर शिफ्ट (PA 2) 10 बटोर लिए। कश्मीर बी और देहात दो लाभ वे एगोनिस्ट स्वतंत्र मान रहे हैं, और यहां तक कि विभिन्न ऊतकों 11 के बीच लगातार बने हुए हैं कि इस तथ्य से उनकी उपयोगिता दोनों। कहीं और गणना 50 मूल्यों चित्रा 2 में डेटा से, पी बी निम्न समीकरण का उपयोग कर की गणना की जा सकती है और चुनाव आयोग के आधार पर:
= 2 एक्स 10 -8 एम prazosin के अभाव में चुनाव आयोग 50
पूर्व में चुनाव आयोग 50prazosin की भावना = 7 एक्स 10 -6 एम
निम्न समीकरण में कश्मीर बी के लिए हल:
लॉग इन करें (डॉ -1) = [बी] लॉग इन – कश्मीर बी लॉग इन करें
जहाँ:
[बी] प्रतिपक्षी एकाग्रता =, या 5 एक्स 10 -9 एम लॉग इन करें (5 एक्स 10 -9 एम) = -8.3
डॉ = अनुपस्थिति में प्रतिपक्षी / चुनाव आयोग 50 की उपस्थिति में चुनाव आयोग 50 मूल्य की खुराक अनुपात। एक दाहिनी ओर बदलाव है, तो यह मान एक से अधिक हो जाएगा। इस प्रकार:
डॉ = 7 एक्स 10 -6 एम / 2 एक्स 10 -8 एम या 700 एक्स 10 -8 एम / 2 एक्स 10 -8 एम = 700/2 = 350
[बी] और डॉ के लिए प्रतिस्थापन:
कश्मीर बी लॉग इन करें – = -8 (350-1) लॉग इन करें
2.54 = -8 – केबी लॉग इन करें
पी बी = 10.54
Prazosin एक α 1 एड्रीनर्जिक recept के साथ सूचना का आदान प्रदान जब prazosin के लिए यह मान प्राप्त मूल्यों के अनुरूप हैphenylephrine को संकुचन मध्यस्थता एड्रीनर्जिक रिसेप्टर α 1 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर सुझाव है कि या 12,13,।
कई कदम इन प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। ऊतकों ऊतक व्यवहार्यता के नुकसान को रोकने के लिए विच्छेदन के बाद पीएसएस में ही रहना चाहिए। किसी भी Isometric पेशी तैयारी निष्क्रिय तनाव 14,15 के खिलाफ अधिक से अधिक बल उत्पन्न करता है कि एक इष्टतम लंबाई-तनाव संबंध नहीं है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोग के लिए, इष्टतम निष्क्रिय तनाव पहले से ऊतकों को निष्क्रिय तनाव की 0.5 ग्राम का संक्षेप में जोड़ने के वेतन वृद्धि द्वारा निर्धारित किया गया था। ऊतक स्वर के बिना शुरू करना चाहिए और उसके बाद संतुलन के 30 मिनट के बाद, ऊतक सक्रिय स्वर उत्पन्न जो KCl (80 मिमी) की एक अधिकतम एकाग्रता के साथ चुनौती दी गई थी। फिर, ऊतक धोया और आधारभूत टोन करने के लिए वापस जाने के लिए अनुमति दी गई थी। आधारभूत पर 15 मिनट के बाद, निष्क्रिय तनाव का एक और 0.5 ग्राम रखा गया था और इस प्रक्रिया का एक पठार तक दोहरायासक्रिय तनाव अतिरिक्त निष्क्रिय तनाव के साथ हासिल की थी। प्रारंभिक प्रयोगों में, निष्क्रिय तनाव की 4 जी कुल महाधमनी के छल्ले में अधिक से अधिक सक्रिय तनाव पीढ़ी को प्राप्त करने के लिए निर्धारित किया गया था, और इस तरह के तनाव के इस कुल राशि पूर्व संतुलन करने के छल्ले पर रख दिया गया है। Procedurally, यह पूर्व निष्क्रिय तनाव आवेदन शून्य करने के लिए सबसे अच्छा है, लेकिन प्रयोग से पहले किसी भी समय किया जा सकता है। प्रयोग या विच्छेदन में किसी भी बिंदु पर, ऊतकों खींच ओवर-, नकारात्मक ऊतक व्यवहार्यता और प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित करेगा। इस कदम के अत्यधिक खिंचाव के उच्चतम संभावना है, के रूप में स्नान में ऊतकों रखकर जब यह सबसे जरूरी है। संख्या और अवधि में पर्याप्त धोने, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रभाव के लिए आवश्यक है। एक दूसरी चुनौती भी जल्द ही ऊतकों आधारभूत तनाव में लौट आए हैं एक प्रारंभिक चुनौती के बाद, या उससे पहले, न्यायपालिका प्रतिक्रियाओं में परिणाम होगा। प्रतिवर्ती गरम / अवरोधकों का अध्ययन करते हैं, तो ऊतकों inhibi के रूप में, इसके अलावा agonist करने से पहले धोया नहीं किया जाना चाहिएटो एकाग्रता कम हो जाएगा।
पृथक ऊतक स्नान assays के लिए उल्लेखनीय फायदे और नुकसान कर रहे हैं।
नुकसान: टिश्यूज हुक पर छल्ले के सर्जिकल हटाने या नियुक्ति के दौरान नुकसान के विभिन्न डिग्री अनुभव हो सकता है। Endothelial सेल महाधमनी अंगूठी की अंदरूनी परत के बाद से इस सेल परत को नुकसान नहीं इतनी के रूप में, देखभाल के हुक पर अंगूठी की नियुक्ति पर लिया जाना चाहिए। ऊतकों भी वे ऊतक स्नान में सक्षम हैं, जिसमें समय के अलग अलग लंबाई हो सकता है, और यह निर्धारित किया है; नहीं सभी ऊतकों में ही हैं। इन पंक्तियों के साथ, ऊतकों समय नियंत्रण हर प्रयोग के लिए एक आवश्यक नियंत्रण बन ऐसी है कि दिन भर में उनकी जवाबदेही में बदल सकता है। इस का एक अच्छा उदाहरण एक ठेठ 8 घंटा प्रयोग के दौरान 100% से सिकुड़ना अधिकतम में सुधार गिनी पिग श्वासनली है। पानी में खराब घुलनशील हैं कि ड्रग्स पीएसएस में बाहर वेग सकता है। अंत में, संचयी एकएन डी एगोनिस्ट को रिसेप्टर desensitization उत्पन्न होती है तो एक agonist विभिन्न परिणामों में परिणाम सकता है कि एक दवा की गैर-संचयी परिवर्धन; एंजियोटेनसिन द्वितीय तेजी tachyphylaxis से पता चलता है जो एक ऐसी दवा है।
लाभ: ऊतक स्नान प्रयोगों का प्राथमिक लाभ में से एक यह वास्तविक समय है कि है; यह करेंगी और तेजी से निष्कर्ष बनाने के लिए और एक प्रयोग के दौरान अगले कदम है, साथ ही निवारण योजना बना सकते हैं के रूप में एक प्रयोग देख सकते हैं। एक प्रयोग करने के लिए एक दिन लेता है। कई ऊतकों को आम तौर पर एक जानवर अपने स्वयं के नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं कि इस तरह के एक जानवर से तैयार किया जा सकता है, और है कि एक प्रयोग करने के लिए शक्ति कहते हैं। दवा के लिए ऊतक का एक अपेक्षाकृत शुद्ध प्रतिक्रिया परीक्षण करने के लिए इतनी के रूप में एक भी अन्य कारकों से ऊतक अलग कर सकते हैं। इस तरह के ऊतक स्नान प्रणाली के रूप में इन विट्रो प्रयोगों में भी एक vivo में प्रयोग की तुलना में दवा की एक छोटी राशि के उपयोग की अनुमति देते हैं।
इस के साथ साथ वर्णित बुनियादी प्रयोगात्मक डिजाइन किया जा सकता हैबड़े पैमाने पर अतिरिक्त पैरामीटर की रिकॉर्डिंग या अन्य बाहरी उत्तेजनाओं की शुरूआत के लिए अनुमति देने के लिए संशोधित। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोड के अलावा innervating नसों 16,17 के बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के लिए अनुमति देते हैं। थर्मल या पीएच जांच के अलावा के साथ, सिकुड़ा प्रतिक्रियाओं पर तापमान और पीएच का प्रभाव भी 18,19 मापा जा सकता है। इसी तरह, ऑक्सीजन आंशिक रूप से या हाइपोक्सिया प्रेरित प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए 2 एन के साथ पूरा में प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस वीडियो में इस्तेमाल किया Isometric सिकुड़ना माप का एक ही मूल सिद्धांतों intracellular कैल्शियम 20 में Isometric तनाव विकास और परिवर्तन के सहवर्ती माप की अनुमति प्रणालियों को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सिस्टम है कि तेजी से एक प्रतिक्रिया के दौरान एक ऊतक के नमूने जमा कर सकते मौजूद बाद से संकेत पारगमन भी आसानी से अध्ययन किया है, एक संकेत पारगमन मार्ग प्रणाली की गतिविधि को biochemically सत्यापित किया जा सकता है कि इस तरह।
क्षेत्रों में काम की भिन्नताऐसा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ipment के भारी है। इस पूरी प्रणाली, निर्माण या स्वचालित या तो हाथ, कई अलग अलग कंपनियों से खरीदा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया ऊतक स्नान और ऊतक धारकों एक घर में मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी मशीन की दुकानें द्वारा हाथ से उड़ा (ऊतक स्नान) और हाथ का निर्माण (धारकों) थे।
The authors have nothing to disclose.
The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
Grass Force-Displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
Tissue Bath | Multiple Sources | ||
Physiological Salt Solution | PSS | ||
Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
50ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
250ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
Micrometer | |||
Custom Stands | |||
Three-Prong Clamps | VWR International | Talon | |
S-Connector | VWR International | Talon | |
Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
Tissue Dissection | |||
Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |