Modelado 3D del lateral Ventrículos y histológico Caracterización de Tejidos periventricular en los seres humanos y de ratón
Summary
Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain’s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.
Abstract
The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.
Introduction
Un ependimarias líneas monocapa de células del sistema ventricular del cerebro que proporciona funciones de barrera y de transporte bidireccionales entre el líquido cefalorraquídeo (LCR) y el líquido intersticial (ISF), 1-3. Estas funciones ayudan a mantener el cerebro tóxico-libre y en equilibrio fisiológico 2,3. En los seres humanos la pérdida de porciones de este revestimiento a través de una lesión o enfermedad no parece resultar en sustitución regenerativa como se encuentra en otros revestimientos epiteliales; más bien la pérdida de cobertura de la célula ependimal parece resultar en astrogliosis periventricular con una malla de los astrocitos que cubren regiones desnudas de las células ependimarias en la superficie ventrículo. Repercusiones graves a mecanismos CSF / cambio ISF y remoción importantes se prevé que el resultado de la pérdida de esta capa epitelial 1,2,4-7.
Una característica común de envejecimiento humano se amplía ventrículos laterales (ventrículomegalia) y edema periventricular asociado como observcado por resonancia magnética y la recuperación de la inversión a los fluidos atenuada resonancia magnética (MRI / FLAIR) 8-14. Para investigar la relación entre ventrículomegalia y la organización celular del revestimiento ventrículo, secuencias de RM humanos postmortem fueron emparejados con las preparaciones histológicas del tejido periventricular ventrículo lateral. En los casos de ventrículomegalia, áreas sustanciales de gliosis habían reemplazado la cobertura celular ependimaria lo largo de la pared del ventrículo lateral. Cuando la expansión ventrículo no se detectó por análisis de volumen a base de MRI, el revestimiento de células ependimarias estaba intacta y gliosis no se detectó a lo largo del revestimiento ventrículo 6. Este enfoque combinatoria representa la primera documentación que detalla los cambios globales en la integridad celular del revestimiento ventrículo lateral usando preparaciones wholemount de partes o toda la pared del ventrículo lateral y modelado 3D de los volúmenes ventriculares 6. Varias enfermedades (enfermedad de Alzheimer, la esquizofrenia) y lesiones (lesión cerebral traumática)mostrar ventrículomegalia como un rasgo neuropatológico temprano. Denudation de áreas del revestimiento de células ependimarias de ese modo se predijo para interferir con la función de las células ependimarias normal y comprometer el equilibrio homeostático entre CSF / fluido ISF y el intercambio de solutos. Por lo tanto, un examen más exhaustivo de los cambios en el sistema ventricular, su composición celular, y la consecuencia de las estructuras cerebrales subyacentes o vecinos en última instancia comenzará a revelar más sobre la neuropatología asociada con la ampliación ventrículo.
La falta de datos de imágenes multimodales y, en particular secuencias de datos longitudinales, junto con un acceso limitado a las correspondientes muestras de tejidos histológicos hace análisis de patologías cerebrales humanas difícil. Fenotipos de modelado que se encuentran en el envejecimiento o enfermedad humana a menudo se puede lograr con modelos de ratón y modelos animales se convierten en uno de nuestros mejores medios para explorar preguntas acerca de la iniciación de la enfermedad humana y la progresión. Varios estudios enratones jóvenes sanos han descrito la citoarquitectura de las paredes del ventrículo lateral y el nicho de células madre subyacente 4,7-15. Estos estudios se han ampliado para incluir el modelado 3D y análisis celular de las paredes del ventrículo a través del envejecimiento 6,15. Ni gliosis periventricular ni ventrículomegalia se observan en ratones de edad, en lugar ratones muestran una zona subventicular relativamente robusto (SVZ) nicho de células madre subyacente a una célula intacta ependimaria forro 6,15. Por lo tanto, existen diferencias específicas de especie sorprendentes tanto en el mantenimiento y la integridad del revestimiento del ventrículo lateral en general durante el proceso de envejecimiento de 6,15. Por lo tanto, a mejores ratones uso para interrogar condiciones que se encuentran en los seres humanos, necesitan ser caracterizado y considerado apropiadamente en cualquier paradigma de modelado diferencias entre las dos especies. A continuación, presentamos los procedimientos para evaluar los cambios longitudinales a los ventrículos laterales y el tejido periventricular asociado tanto en humanos como mOuse. Nuestros procedimientos incluyen representación 3D y volumetría de ambos ventrículos del ratón y humanos, y el uso de análisis inmunohistoquímico de las preparaciones de todo el montaje de tejido periventricular para caracterizar tanto la organización celular y la estructura. Juntos, estos procedimientos proporcionan un medio para caracterizar cambios en el sistema ventricular y el tejido periventricular asociado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentamos herramientas y protocolos que pueden utilizarse para evaluar la integridad del sistema ventricular del cerebro en ratones y en seres humanos. Estas herramientas, sin embargo, pueden también ser aplicados a otras estructuras cerebrales o sistemas de órganos que sufren cambios debido a una lesión, enfermedad, o durante el proceso de envejecimiento 14,21,22. Las estrategias presentadas toma ventaja de software que permite la alineación de secuencias de RM transversales y longitudinales para gener…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
An NINDS Grant NS05033 (JCC) supported this work. The University of Connecticut RAC, SURF and OUR programs provided additional support.
Materials
| Name of the Materal/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/mL in PBS |
Riferimenti
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