I protocolli descrivono due sistemi di test in vitro di tossicità dello sviluppo (UKK e UKN1) a base di cellule staminali embrionali umane e studi trascrittoma. I sistemi di test prevedono pericolo tossicità per lo sviluppo umano, e possono contribuire a ridurre studi sugli animali, i costi e il tempo necessario per le prove della sicurezza chimica.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Umano cellule staminali pluripotenti Basato Tossicità per lo sviluppo saggi per Chemical Screening e Safety Systems Biology generazione dati
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Protocolli efficaci per differenziare le cellule staminali pluripotenti umane a vari tessuti in combinazione con le tecnologie omiche aprono nuovi orizzonti per la tossicità in vitro test in di potenziali farmaci. Per fornire una solida base scientifica per tali dosaggi, sarà importante per ottenere informazioni quantitative sul corso tempo di sviluppo e sui sottostanti meccanismi regolatori di approcci biologia dei sistemi. Due saggi sono stati quindi sintonizzati qui per queste esigenze. Nel sistema di test UKK, cellule staminali embrionali umane (hESC) (o altre cellule pluripotenti) sono lasciate per differenziare spontaneamente per 14 giorni in corpi embrionali, a consentire la generazione di cellule di tutte e tre strati germinali. Questo sistema ricapitola passaggi chiave del primo sviluppo embrionale umano, ed è in grado di prevedere in anticipo embrionale tossicità / teratogenicità specifici umano, se le cellule sono esposti a sostanze chimiche durante la differenziazione. Il sistema di test UKN1 si basa sulla differenziazione hESC a un populationi di neuroectodermica progenitore (NEP), le cellule per 6 giorni. Questo sistema ricapitola precoce sviluppo neurale e prevede presto neurotossicità per lo sviluppo e cambiamenti epigenetici innescati da sostanze chimiche. Entrambi i sistemi, in combinazione con studi transcriptome microarray, sono adatti per l'identificazione di marcatori di tossicità. Inoltre, essi possono essere usati in combinazione per generare dati di input per l'analisi dei sistemi biologia. Questi sistemi di prova hanno vantaggi rispetto ai tradizionali studi tossicologici che richiedono grandi quantità di animali. I sistemi di test, possono contribuire ad una riduzione dei costi per lo sviluppo di farmaci e la valutazione della sicurezza chimica. La loro combinazione mette in luce soprattutto sui composti che possono influenzare lo sviluppo neurologico specifico.
Introduzione
La capacità delle cellule staminali embrionali umane (hESC) di differenziarsi in vari tipi di cellule ha aperto una nuova era di tossicità test in vitro 1, modelli di malattia e della medicina rigenerativa 2. Le cellule staminali sono dotati della capacità di auto-replicarsi, per mantenere il loro stato pluripotente, e di differenziarsi in cellule specializzate 3,4. Le proprietà di hESC (capacità di differenziarsi a tutti i principali tipi di cellule) si trovano anche in altre cellule staminali pluripotenti umane, come le cellule umane pluripotenti indotte staminali (hiPSC) o le cellule generate da trasferimento nucleare
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Il seguente protocollo è stato eseguito utilizzando la linea di cellule staminali embrionali umane (hESC) H9. Questa linea cellulare è stata regolarmente coltivati su fibroblasti di topo mitoticamente inattivato embrionali (MEF) in coltura hESC multimediale integrato con bFGF e poi coltivate in mezzi di cellule staminali su 6 centimetri piastre Petri rivestite di matrice membrana basale come matrigel, per sbarazzarsi di MEF. Le cellule H9 di> 80% lastre confluenti sono stati utilizzati per un ulteriore passaggio. Cellule H9 coltivate su piastre di matrice membrana basale sono stati utilizzati per la formazione EBS. Tutte le procedure di ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Esposizione al mercurio metile in sistema di prova UKK
Il saggio di citotossicità è stata eseguita con H9 EBs per ottenere un valore di IC 10 (riduzione della vitalità del 10%) per la citotossicità di metilmercurio (Figura 1). Abbiamo anche eseguito un microarray basato (piattaforma Affymetrix) studio biomarker. La H9 EBs sono stati esposti al mercurio metilico (0.25 e 1 micron) per 14 giorni. Il giorno 14, i campioni sono stati raccolti utilizzando TRIzol e RNA è.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Gli approcci tradizionali alla sperimentazione tossicologica coinvolgono ampi studi su animali rendendo così i test costoso e richiede tempo. Inoltre, a causa delle differenze interspecie gli studi sulla sicurezza animale preclinici non sono sempre validi per prevedere effetti di tossicità di potenziali farmaci rilevanti per gli esseri umani. Anche se i primati non umani sono più prevedibili, ancora forte etica, e le richieste socioeconomiche sono rapidamente alzando dalla società moderne per sviluppare sensibili e robu.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani e Cornelia Böttinger per l'eccellente supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione tedesca per la ricerca (RTG 1331) e del Ministero tedesco per la ricerca (BMBF).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: miscela di nutrienti F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | integratore GlutaMAX |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Soluzione |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, senza calcio, senza magnesio |
| mTeSR medio | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V piastra inferiore | VWR | 734-0483 | Piastra, Microwell, V BTTM, 96 pozzetti, sterile 1 * 50 ST |
| V coperchio della piastra inferiore | VWR | 634-0011 | Coperchio, piastre per microtitolazione, anello di cond. 1 * 50 |
| ST Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillina-streptomicina, |
| acqua distillata liquida | Life Technologies | 15230-089. | Acqua distillata sterile |
| Umano FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fattore di crescita dei fibroblasti basico, umano ricombinante, senza animali |
| Filtro 0,22 μ m | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μ m, polietersulfone, 250 ml, radiosterilizzato |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, qualificato hESC Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | flaconcino da 5 ml |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Soluzione di stabilizzazione | Life Technologies | AM7020 | Stabilizza e protegge l'integrità dell'RNA nei campioni non congelati. |
| 70 μ m Filtro cellulare | Becton Dickinson | 352350 | Filtro cellulare con 70 μ m Maglia di nylon |
| 35 μ m Filtro a celle del coperchio, 5 provetta da ml | Becton Dickinson | 352235 | provetta da 5 ml in polistirene a fondo tondo, con tappo per filtro cellulare (35 μ m) |
| Tubo sterile in polipropilene da 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | Tubo in polipropilene da 50 ml con fondo conico, pallone sterile |
| T75 | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flaconi |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| piastre a fondo ottico a 96 pozzetti | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferina | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorfina | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R& D Systems | 233-FB | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R& D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescina | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| Inibitore ROCK Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenio | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoetanolo | Gibco Invitrogen | 31350-010 | |
| [header] | |||
| Elenco dei kit | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Kit di ibridazione, lavaggio e colorazione GeneChip | Affymetrix | 900721, 22, 23 | Questo kit fornisce tutti i reagenti necessari per l'ibridazione, il lavaggio e la colorazione dei microarray. |
| Set DNase senza RNASI | QIAGEN | 79254 | |
| [header] | |||
| Elenco delle apparecchiature | |||
| Microscopio invertito | Genechip Olympus | IX71 | |
| - 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix Affymetrix | ||
| Scanner Gene-Chip-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| [header] | |||
| Elenco dei software | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Strumenti online per l'annotazione funzionale DAVID Onto-tools Laboratorio |
Riferimenti
- Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
- Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceut....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
