Всего сотовый Bioreporter подход к оценке переноса и биодоступности органических загрязнителей в ненасыщенных систем водоснабжения
Summary
Вся камера bioreporter проба с Burkholderia sartisoli RP037-МКТО был разработан для обнаружения фракции органического загрязнителя (т.е. флуорена) Доступные для бактериального разложения после активного транспорта по мицелия, соединяющих заполненные воздухом поры в ненасыщенной модели водной системы.
Abstract
Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.
Introduction
Почва густонаселенных от широкого спектра микроорганизмов, таких как 1,2 бактерий. Однако условия в этой среде обитания являются сложными, особенно с точки зрения наличия воды 3. Бактерии постоянно нужно искать оптимальных условий в гетерогенных средах 4, но отсутствие непрерывных водных пленок приводит к ограничению подвижности 5 препятствуя им свободно распространяться. Кроме того, скорость диффузии растворенных веществ (например, питательных веществ) снижены при ненасыщенных условиях 6. Таким образом, бактерии и питательные вещества часто физически разделены и питательных доступность ограничивается 3. Как следствие, транспортный вектор химических соединений, которые не требуют непрерывного водную фазу может помочь преодолеть эти ограничения. В самом деле, многие микроорганизмы, такие как грибы и оомицетов разработали нитевидные формы роста, позволяющее им расти через заполненные воздухом поры, тем самым достигая и MOBIлизинг и физическое отделены питательные вещества 7 и углеродистую 8 веществ на большие расстояния. Они могут даже выступать в качестве биологических векторов транспорта, которые поставляют сахар и другие источники энергии бактерий 9. Поглощение и транспорт в мицелиальных организмов было также показано для гидрофобных органических загрязнителей, таких как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) в Pythium ultimum 10 или в эндомикоризными грибов 11. С ПАУ вездесущие и плохо растворимые загрязнения воды 12 в почве, мицелий-опосредованный транспорт может способствовать увеличению загрязнений биодоступность для потенциальных бактериальных деструкторов. В то время как общее количество переноса загрязняющих веществ может быть определена количественно, непосредственно химическими средствами 10, биодоступность загрязняющих веществ, транспортируемых в мицелии разрушающих бактерий и других организмов не может быть легко оценена.
Следующий протокол представляет собой метод оценки влияния myceЛия на загрязнений биодоступности бактериальных деструкторов в прямом порядке; это позволяет собирать информацию о пространственно-временной воздействия загрязняющих веществ на микробных экосистем. Мы опишем, как создать сложную ненасыщенный систему микрокосм имитации воздух-вода интерфейсы в почве, связывая физически отделены точечный источник ПАУ ПАУ унижающие bioreporter бактерий через мицелия транспортных векторов. Поскольку в воздухе транспортного исключается, эффект мицелия на основе транспорта на ПАУ биодоступность для бактерий могут быть изучены в изолированной образом. Более подробно, три кольца ПАУ флуорена мицелия организм Питиум ultimum и bioreporter бактерии Burkholderia sartisoli RP037-МКТО 13 были применены в описанных микромира установок. Бактерия B. sartisoli RP037-МКТО был первоначально построен для изучения фенантрена потоков в ячейку 14 и выражает усиленный зеленый флуоресцирующий белок (EGFP), в результате потока ПАУ вклетка, в то время как красный флуоресцирующих mCherry выражается конститутивно. Подробная информация о репортера строительства определяется Текон и др. 13 В предварительных испытаний, бактерия не выявлено плавание и только очень медленно способность роения. Было способны мигрировать медленно гифы Pythium ultimum, когда применяется в качестве плотной суспензии в верхней части гиф. Поскольку бактерии были встроены в агарозе в следующей методике, миграция на гиф не происходило.
Использование конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), то bioreporter бактерии могут быть визуализированы непосредственно в микрокосмах и экспрессия EGFP может быть количественно по отношению к количеству клеток (пропорционального сигналу mCherry) с помощью программного обеспечения ImageJ. Это позволяет сравнивать биологическую качественно различных сценариев (например, выше или ниже). FLU было установлено, что биодоступной после мицелия транспорта П. ultimum (т.е. егобыл выше, чем в отрицательном контроле). Кроме того, протокол описывает, как количественно общее количество мицелия-опосредованного транспорта через химическими средствами и проверить загрязнений биодоступность с использованием кремниевых покрытием стекловолокна (SPME волокна) в идентичных микрокосмах. Результаты использования этой установки микрокосм были опубликованы и обсуждены на комбинации P. ultimum, флуорена и B. sartisoli RP037-МКТО 15. Здесь акцент лежит на подробным описанием метода и выявления потенциальных ловушек протокола, чтобы обеспечить эти знания для возможного дальнейшего применения. Дальнейшие применения могут включать различные грибковые, бактериальные виды (например, с загрязненных участков) и других загрязняющих веществ (например, пестициды) или по загрязнителям питания (например, в возрасте почвы).
Protocol
Representative Results
Discussion
Представлены настройки микрокосм зарекомендовали себя для изучения биодоступности пространственно разделенных химических веществ, унижающему человеческое достоинство организмов после поглощения и транспорта по мицелия. Потенциал в газовой фазе перенос частично летучих соединени…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit Würz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the ‘Chemicals in the Environment’ (CITE) research program of the Helmholtz Association.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: | 100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest | ||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 | pH 6.0 | ||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2 % | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: | 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8 | ||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: | 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | ||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| imageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland |
References
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
- Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
- Griffin, D. M., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 141-151 (1981).
- Papendick, R. I., Camprell, G. S., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 1-22 (1981).
- Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
- Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
- Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
- Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
- Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
- Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
- Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
- Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
- Smibert, R. M., Krieg, R. M., Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B., et al. . Manual of methods for general bacteriology. 19, 409-443 (1981).
- Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Pedersen, C., Sylvia, D., Mukerji, K. G. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Vol. 19, 195-222 (1996).
- Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
