A Whole Hücre Bioreporter Yaklaşımı Su Doymamış Sistemleri Organik Kontaminantların Taşıma ve Biyoyararlanımını Değerlendirmek için
Summary
Burkholderia sartisoli RP037-mChe ile bir bütün hücre bioreporter deney, bir su doymamış model sisteminde hava dolu gözenekler köprü misel aktif taşıma sonra bakteriyel indirgenmesi için uygun bir organik kirlilik (örneğin, floren) fraksiyonları tespit etmek için geliştirilmiştir.
Abstract
Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.
Introduction
Toprak yoğun bakteri gibi mikroorganizmalar 1,2 geniş bir yelpazede ile doldurulur. Ancak, bu yaşam koşulları, özellikle su durumu 3 açısından, zorlu. Bakteriler kalıcı heterojen ortamlarda 4 optimal koşulları aramak gerekir, ancak sürekli su filmlerin olmaması özgürce yaymak için onları engelleyen kısıtlı hareket 5 sonuçlanıyor. Ayrıca, çözünenlerin difüzyon hızları (örneğin, besinler) doymamış koşullarda 6 altında indirilir. Böylece, bakteri ve besin genellikle fiziksel ayrılır ve besin erişilebilirlik 3 sınırlıdır. Bunun bir sonucu olarak, sürekli bir su-fazı gerektirmez kimyasal bileşikler için bir taşıma vektörü, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için yardımcı olabilir. Aslında, bu tür mantar ve Oomycetes kadar mikroorganizmalar bu şekilde ulaşmak ve mobi hava dolu gözenekli boşluklar sayesinde büyümesini sağlayarak lifli bir büyüme formu geliştirdiklizing fiziksel uzun mesafelerde besin 7 ve 8 karbonlu maddeler ayrılır. Hatta bakteri 9 şekerler ve diğer enerji kaynakları sağlar biyolojik taşıma vektörü olarak hareket edebilir. Alım ve mantar organizmalarda taşıma aynı zamanda, Pythium ultimum 10 veya arbusküler mikoriza mantar 11 polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH), hidrofobik organik kirletici maddeler için gösterilmiştir. PAH her yerde ve suda az çözünen kirleticiler toprakta 12 olduğundan, Miseller-aracılı taşıma potansiyeli bakteriyel degraders için kirletici biyo artırmaya yardımcı olabilir. Kirletici taşıma miktarı kimyasal doğrudan ölçülebilir Oysa aşağılayıcı bakteri ve diğer organizmalar için misel tarafından taşınan kirleticilerin biyolojik kolaylıkla değerlendirilebilir edilemez, 10 anlamına gelir.
Aşağıdaki protokol myce etkisini değerlendirmek için bir yöntem sunardoğrudan bir şekilde bakteri degraders için kirletici biyo üzerinde lia; mikrobiyal ekosistemler üzerindeki kirleticilerin zamanmekansal etkisi hakkında bilgi toplama sağlar. Biz nasıl misel ulaşım vektörler aracılığıyla PAH-aşağılayıcı bioreporter bakteri ile bir fiziksel ayrılmış PAH noktası kaynağını bağlayarak toprakta hava-su arabirimleri taklit ayrıntılı bir doymamış evren sistemini kurmak açıklar. Havadaki ulaşım hariç Çünkü, bakteriler için PAH biyoyararlanım üzerine misel-temelli ulaşım etkisi izole bir şekilde ele alınabilir. Daha ayrıntılı olarak, üç halka PAH fluoren, misel organizma Pythium ultimum ve bioreporter bakteri Burkholderia sartisoli RP037-mChe 13 tarif evren kurulumları uygulanmıştır. bakteri B. sartisoli RP037-mChe başlangıçta hücre 14'e fenantren akıları çalışma yapılmıştır ve PAH akımının bir sonucu olarak, yeşil flüoresan protein (EGFP) geliştirilmiş ifade ederMCherry kurucu olarak ifade edilen kırmızı flüoresan oluşturan ise hücre. Muhabir inşaat ile ilgili detaylı bilgiler Tecon et al., Ön testlerde 13 ile verilir, bakteri yok yüzme ve sadece çok yavaş kaynaşma yeteneği ortaya çıkardı. Bu hif üzerine yoğun bir süspansiyon halinde tatbik edildiği zaman Phytium ultimum hif yavaş yavaş göç edebildi. Bakteriler aşağıdaki protokol agaroz gömülü olduğundan, hif üzerinde göç meydana gelmedi.
Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanarak, bioreporter bakteri mikrokosmlarından doğrudan görülebilir ve eGFP sentezlenmesi yazılım ImageJ yardımıyla (MCherry sinyale orantılı), hücrelerin miktarı ile ilgili olarak tayin edilebilir. Bu farklı senaryolarda niteliksel biyo karşılaştırarak izin verir (yani, daha yüksek veya daha düşük). GRİP P. misel nakliyeden sonra bio-yararlı olduğu bulunmuştur ultimum'a (yani, onu), negatif kontrol olarak daha yüksektir. Ayrıca, protokol kimyasal yollarla Miseller-aracılı taşıma miktarını ölçmek için ve aynı mikrokosmlarından silikon kaplı cam elyaf (SPME lifler) ile kirletici biyo doğrulamak açıklamaktadır. Bu evren kurulumu kullanarak sonuçları yayınlandı ve P. kombinasyonu için tartışılmıştır ultimum, fluoren ve B sartisoli RP037-mChe 15. Burada, odak potansiyeli daha uygulamalar için bu bilgiyi sağlamak için detaylı bir yöntem açıklama ve protokol potansiyel tuzaklar belirlenmesi yatıyor. Diğer uygulamalar (kontamine sitelerden örneğin,) çeşitli mantar, bakteri türlerini içerir ve diğer kirleticiler (örn, böcek ilaçları) veya kirletici kaynağı (örneğin, yaşlı topraklar) olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
sunulan evren kurulum misel tarafından alımı ve ulaşım sonra organizmaların aşağılayıcı mekansal ayrılmış kimyasalların biyolojik çalışma uygun kanıtladı. Kısmen uçucu bileşiklerin potansiyel gaz-faz taşıma önlenir ve bakteriyel bioreporter hücrelerinin hassas sistemin minimum rahatsızlık ile böylece ayrıntılı numune hazırlama olmadan görsel ve edilebilmektedir. Aynı zamanda, numunenin kimyasal analizi, kolay bir elde edilen sonuçların iyi kontrolü için, toplam taşıma ölçümü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit Würz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the ‘Chemicals in the Environment’ (CITE) research program of the Helmholtz Association.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: | 100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest | ||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 | pH 6.0 | ||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2 % | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: | 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8 | ||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: | 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | ||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| imageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland |
References
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
- Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
- Griffin, D. M., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 141-151 (1981).
- Papendick, R. I., Camprell, G. S., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 1-22 (1981).
- Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
- Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
- Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
- Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
- Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
- Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
- Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
- Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
- Smibert, R. M., Krieg, R. M., Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B., et al. . Manual of methods for general bacteriology. 19, 409-443 (1981).
- Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Pedersen, C., Sylvia, D., Mukerji, K. G. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Vol. 19, 195-222 (1996).
- Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
