Qui presentiamo un metodo economico per definire le interazioni chimico-genetiche nel lievito in gemmazione. L'approccio si basa su tecniche fondamentali nella biologia molecolare del lievito ed è adatto per l'interrogazione meccanicistica di piccole e medie collezioni di sostanze chimiche e altri ambienti multimediali.
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Articolo metodologico
Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in
In questo articolo
Sommario
Abstract
Determinare la modalità di azione delle sostanze chimiche bioattive è di interesse per una vasta gamma di accademici, farmaceutico, e gli scienziati industriali. Saccharomyces cerevisiae, o lievito in erba, è un modello eucariote che una collezione completa di ~ 6.000 mutanti di delezione genica e hypomorphic gene essenziale mutanti sono disponibili in commercio. Queste collezioni di mutanti possono essere utilizzati per rilevare sistematicamente interazioni chimico-gene, cioè geni necessari a tollerare una sostanza chimica. Queste informazioni, a sua volta, riporta sulla modalità probabile di azione del composto. Qui si descrive un protocollo per la rapida identificazione di interazioni chimiche-genetico in erba lievito. Noi dimostriamo il metodo utilizzando l'agente chemioterapico 5-fluorouracile (5-FU), che ha un meccanismo ben definito di azione. I nostri risultati mostrano che il vagabondo nucleare rna exosome e riparazione del DNA enzimi sono necessari per la proliferazione in presenza di 5-FU, che è coerente con le precedenti microarray approcci basati su codice a barre chimico genetiche e le conoscenze che il 5-FU influisce negativamente sia il metabolismo RNA e DNA. Sono descritti anche i protocolli di validazione richieste di questi schermi ad alto rendimento.
Introduzione
Gli strumenti e le risorse disponibili nel organismo modello Saccharomyces cerevisiae genetici hanno permesso grandi studi di genomica funzionale che forniscono insieme nuovi indizi su come i geni funzionano come reti per soddisfare i requisiti dei sistemi biologici. La pietra angolare di questi strumenti è stata la creazione collaborativa di un set completo di delezioni geniche non essenziali di tutte le fasi di lettura aperte nel lievito 1,2. Un'osservazione sorprendente è che solo il ~ 20% dei geni di lievito sono necessari per la vitalità quando cresciuto come aploidi in condizioni standard di laboratorio. Ciò evidenzia la capacità di una ....
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Protocollo
NOTA: Il flusso generale di questa procedura è illustrata nella figura 2.
1. Determinazione della Dose Growth-inibitorio
- Preparazione del lievito cultura durante la notte
NOTA: I media la crescita del lievito estratto-peptone-destrosio (YEPD) utilizzato in questo protocollo è una ricetta standard 13.- Streak out BY4741 (Mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) le cellule su un piatto agar YEPD e incubare per 48 ore a 30 ° C o fino a formare colonie visibili.
- Preparare culture durante la notte inoculando 5 ml di YEPD mezzi liquidi in un recipiente di coltura sterile con un....
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Risultati
Come una convalida di questo approccio abbiamo effettuato un rappresentante chimica schermo interazione genetica dell'agente chemioterapico 5-fluorouracile (5-FU) seguendo il protocollo descritto sopra. 5-FU si caratterizza per interrompere timidilato sintasi così come DNA e RNA metabolismo 18. Le interazioni genetiche chimiche su 5-FU sono ben studiati e sono stati studiati con tecniche di lievito barcode microarray utilizzando collezioni cancellazione eterozigoti e omozigoti 8,19. Qui mostria.......
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Discussione
Delineato qui è un approccio per la generazione di profili di interazione chimico-genetico. Il metodo è semplice: confrontando le dimensioni delle colonie di ciascun ceppo in complete collezioni delezione genica in presenza e in assenza di una sostanza chimica, tutti i geni necessari per tollerare un insulto chimica sono identificati. Analisi annotazione arricchimento della lista risultante dei ceppi sensibili può quindi essere utilizzato per fornire una visione in una modalità di azione chimica. Mentre questo protocoll.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
La ricerca in laboratorio CJN è sostenuto da sovvenzioni di funzionamento dal NSERC, la Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI), e la Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Estratto di lievito | BioBasic | G0961 | Per terreni liquidi/solidi YEPD aggiungere alla concentrazione finale dell'1% (p/v) |
| Polvere di tyrptone | BD Biosciences | 211820 | Per terreni liquidi/solidi YEPD aggiungere alla concentrazione finale del 2% (p/v) |
| Destrosio | Anachemia | 31096-380 | Per i mezzi liquidi/solidi YEPD aggiungere al 2% di concentrazione finale (p/v) — Non sterilizzare in autoclave. Preparare la soluzione madre al 20%, filtrare e sterilizzare e aggiungere al terreno dopo la sterilizzazione in autoclave. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | Per YEPD solidi aggiungere al 2% di concentrazione finale (p/v)G418 |
| A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepara 1.000 stock a 200 mg/ml in dH2O e filtro sterilizzare. | |
| piastra a 12 pozzetti | Greiner Bio One | 655180 | |
| provette per coltura da 5 ml | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| piastra Petri da 10 cm | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | robot di spillatura per array microbici ad alta produttività |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Strumenti | PLU-001 | Scatola da 200 piatti |
| 384 RePad a perno corto | Strumenti Singer | RP-MP-384 | Scatola da 1.000 pad |
| 1536 RePad a pin corto | Strumenti Singer | RP-MP-1536 | Scatola da 1.000 pastiglie |
| Strumenti di spillatura alternativi: | |||
| Sistemi Robtic completamente automatizzati | S& P robotics | http://www.sprobotics.com | Sono disponibili diversi sistemi robitici e di imaging automatizzati per la gestione delle colonie. |
| Strumenti di bloccaggio manuale | V& P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Strumenti e accessori per la replica portatile. |
Riferimenti
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science.
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Ristampe e permessi
