में रासायनिक आनुवंशिक बातचीत की तेजी से पहचान<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.
Abstract
बायोएक्टिव रसायनों की कार्रवाई की विधा का निर्धारण शैक्षिक, दवा की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए ब्याज, और औद्योगिक वैज्ञानिकों की है। Saccharomyces cerevisiae, या नवोदित खमीर, एक मॉडल यूकेरियोट है जिसके लिए ~ 6000 जीन विलोपन म्यूटेंट और hypomorphic आवश्यक जीन की एक पूरी संग्रह म्यूटेंट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। म्यूटेंट के इन संग्रहों में व्यवस्थित ढंग से एक रासायनिक सहन करने के लिए आवश्यक रासायनिक जीन बातचीत, यानी जीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह जानकारी, बारी में, यौगिक की कार्रवाई की संभावना मोड पर रिपोर्ट। यहाँ हम नवोदित खमीर में रासायनिक आनुवंशिक बातचीत की तेजी से पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। हम कार्रवाई की एक अच्छी तरह से परिभाषित तंत्र है जो chemotherapeutic एजेंट 5 fluorouracil (5-फू), का उपयोग करते हुए विधि प्रदर्शित करता है। हमारे परिणाम परमाणु आवारा exosome और डीएनए की मरम्मत एंजाइमों पिछले मीटर के साथ संगत है, जो 5-फू की उपस्थिति में प्रसार के लिए आवश्यक हैं शाही सेना बताते हैं किआधारित बार कोडिंग रासायनिक आनुवंशिक दृष्टिकोण और 5-फू पर प्रतिकूल दोनों आरएनए और डीएनए चयापचय को प्रभावित करता है कि ज्ञान icroarray। इन उच्च throughput स्क्रीन के लिए जरूरी सत्यापन प्रोटोकॉल भी वर्णित हैं।
Introduction
आनुवंशिक उपकरण और मॉडल जीव Saccharomyces cerevisiae में उपलब्ध संसाधनों का सामूहिक रूप से जीन नेटवर्क जैविक प्रणालियों की आवश्यकताओं को पूरा करने के रूप में कार्य कैसे में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करना है कि बड़े पैमाने पर कार्यात्मक जीनोमिक्स के अध्ययन के लिए सक्षम है। इन उपकरणों की आधारशिला खमीर 1,2 में सभी खुले पढ़ने के तख्ते की गैर जरूरी जीन विलोपन का एक पूरा सेट के सहयोगी सृजन किया गया था। एक हड़ताली अवलोकन मानक प्रयोगशाला परिस्थितियों में haploids के रूप में विकसित जब खमीर जीन की केवल ~ 20% व्यवहार्यता के लिए आवश्यक हैं कि था। इस वैकल्पिक जैविक रास्ते के उपयोग के माध्यम से जीनोमिक perturbations के खिलाफ बफर करने के लिए एक सेल की क्षमता पर प्रकाश डाला गया। जेनेटिक व्यक्तिगत रूप से व्यवहार्य हैं कि म्यूटेंट, लेकिन संयोजन में घातक, जुड़ा हुआ है या अभिसरण समानांतर जैविक रास्ते संकेत और जैविक समारोह का वर्णन है कि आनुवंशिक बातचीत के नेटवर्क के रूप में। सशर्त ते के विकास के साथआवश्यक जीन की mperature के प्रति संवेदनशील और hypomorphic एलील प्रौद्योगिकी गैर जरूरी जीन 3,4 का अध्ययन करने के लिए सीमित नहीं किया गया है। इस अवधारणा को भी इसी सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल जीनों 5 साथ क्लस्टर illustrating कैसे एक निष्पक्ष आनुवंशिक बातचीत नक्शा उत्पादन एक जीनोमिक पैमाने पर लागू किया गया है।
आनुवंशिक नेटवर्क के रासायनिक perturbations नकल जीन विलोपन (चित्रा 1) 6। अतिसंवेदनशीलता के लिए विलोपन उपभेदों के एक उच्च घनत्व सरणी के खिलाफ विकास निरोधात्मक यौगिकों क्वैरी रासायनिक तनाव को सहन करने के लिए आवश्यक है कि जीन की एक सूची है, यानी एक रासायनिक आनुवंशिक बातचीत प्रोफाइल को पहचानती है। आनुवंशिक बातचीत की तरह, रासायनिक पुस्तकालयों की बड़े पैमाने पर स्क्रीन कार्रवाई क्लस्टर एक साथ सात की एक ऐसी ही विधा के साथ यौगिकों दिखाया है। इसलिए, एक यौगिक के रासायनिक आनुवंशिक बातचीत प्रोफाइल की स्थापना के द्वारा कार्रवाई की विधा LAR के साथ तुलना करके निष्कर्ष निकाला जा सकता हैजीई पैमाने पर सिंथेटिक आनुवंशिक और रासायनिक आनुवंशिक बातचीत 8,9 डेटासेट।
यौगिकों के स्कोर से पूछताछ कर रहे हैं, जहां बड़े पैमाने पर रासायनिक-आनुवंशिक स्क्रीन, बारकोड प्रतियोगिता assays के द्वारा प्रदर्शन किया गया है। इस दृष्टिकोण में, विलोपन उपभेदों के जमा संग्रह एक रसायन युक्त मीडिया की एक छोटी मात्रा में कई पीढ़ियों के लिए सामूहिक रूप से उगाया जाता है। प्रत्येक विलोपन उत्परिवर्ती एक अद्वितीय आनुवंशिक बारकोड बंदरगाहों के बाद से, विलोपन उपभेदों के पूल के भीतर व्यक्तिगत म्यूटेंट की व्यवहार्यता / विकास माइक्रोएरे या उच्च throughput अनुक्रमण 10 ने पता लगाया है।
एक bioactive यौगिक युक्त ठोस अगर पर हो शारीरिक रूप से तैनात म्यूटेंट की कॉलोनी आकार की निगरानी के द्वारा फिटनेस inferring भी रासायनिक आनुवंशिक बातचीत 11,12 की पहचान करने के लिए एक प्रभावी तरीका है। यह दृष्टिकोण प्रतियोगिता आधारित स्क्रीनिंग के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करता है और रसायनों के छोटे पुस्तकालयों परख करने की क्रिया के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।यहाँ उल्लिखित एस में रासायनिक आनुवंशिक बातचीत की एक सूची का निर्माण करने के लिए एक सरल पद्धति है जीव विज्ञान जोड़तोड़ या बुनियादी सुविधाओं के आणविक पर निर्भर नहीं करता है कि cerevisiae। यह केवल एक खमीर विलोपन संग्रह, एक रोबोट या मैनुअल लगाए तंत्र, और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
रासायनिक आनुवंशिक बातचीत प्रोफाइल को पैदा करने के लिए एक दृष्टिकोण यहाँ दिये। विधि सरल है: एक रसायन की उपस्थिति और अनुपस्थिति में व्यापक जीन विलोपन संग्रह में प्रत्येक तनाव की कॉलोनी आकार की तुलना द्…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CJN प्रयोगशाला में अनुसंधान NSERC, कनाडा के कैंसर सोसायटी अनुसंधान संस्थान (CCSRI), और कनाडा के स्तन कैंसर फाउंडेशन (ईसा पूर्व-युकोन शाखा) से परिचालन अनुदान द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12 well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
Riferimenti
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