Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.
Abstract
Biyolojik olarak aktif kimyasal etki şeklinin belirlenmesi, akademik, ilaç geniş bir ilgi ve endüstriyel bilim göstermektedir. Saccharomyces cerevisiae ya da çiçek mayası bir model ökaryot olduğu ~ 6.000 gen silme mutantları ve hypomorphic elzem genin tam bir koleksiyon mutantlar ticari olarak temin edilebilir. Mutantlar bu koleksiyonları sistematik bir kimyasal tolere gerekli kimyasal gen etkileşimler, örneğin genleri tespit için de kullanılabilir. Bu bilgiler, sırayla, bileşiğin etkime olası moduna bildirir. Burada maya tomurcuklanma kimyasal genetik etkileşimin hızlı tespit edilmesi için bir protokol açıklar. Bu eylem, iyi tanımlanmış bir mekanizmaya sahiptir, kemoterapötik madde, 5-flüorourasil (5-FU), kullanılarak yöntemi göstermektedir. Sonuçlarımız, nükleer TRAMP eksozom ve DNA onarımı enzimler önceki m ile tutarlıdır 5-FU mevcudiyetinde çoğalma için gerekli olan RNA olduğunu göstermektedirtabanlı barkod kimyasal genetik yaklaşımlar ve 5-FU olumsuz hem RNA ve DNA metabolizmasını etkilediğini bilgiyi icroarray. Bu, yüksek verimli taramalara gerekli doğrulama protokolleri de tarif edilmektedir.
Introduction
genetik araçlar ve model organizma Saccharomyces cerevisiae mevcut kaynakların topluca genler ağları biyolojik sistemlerin gerekliliklerini yerine getirmek olarak işlev nasıl yeni anlayış sağlamak büyük ölçekli fonksiyonel genomik çalışmalar sağlamıştır. Bu araçların taşı maya 1,2 bütün açık okuma çerçeveleri zorunlu olmayan gen silme komple bir set işbirlikçi kurulmasıdır. Çarpıcı bir gözlem, standart laboratuvar koşulları altında haploidlerin olarak yetiştirilen maya genlerinin ~% 20 canlılığı için gerekli oldu. Bu alternatif, biyolojik yolların kullanılması ile genomik düzensizliklerin karşı tampon bir hücrenin yeteneğini ortaya koymaktadır. Genetik ayrı ayrı yaşayabilir mutantlar, ancak birlikte öldürücü, bağlı veya yakınsak paralel biyolojik yollar sinyal ve biyolojik işlevi açıklayan genetik etkileşim ağları oluştururlar. Koşullu te gelişmesiyle birlikteEsas teşkil eden genlerin mperature duyarlıdır ve hypomorphic allelleri teknolojisi esansiyel olmayan genlerin 3,4 çalışması ile sınırlı değildir. Bu kavram, benzer hücresel proseslerle genlerin 5 bir araya gelip nasıl çalıştığını gösteren bir tarafsız genetik etkileşimin ilk üreten bir genomik ölçekte uygulanmıştır.
Genetik ağların Kimyasal tedirginlikler mimik gen delesyonlar (Şekil 1) 6. Aşırı duyarlılık için, silme soylarının yüksek yoğunluklu dizisine doğru büyüme önleyici bileşikler sorgulama kimyasal stresi tolere için gerekli olan genlerin bir listesini, yani, kimyasal bir genetik etkileşim profili tanımlar. Genetik etkileşimleri gibi kimyasal kütüphanelerin büyük ölçekli ekranlar aksiyon küme bir araya 7 benzer bir modu ile bileşiklerin göstermiştir. Bu nedenle, bir bileşiğin kimyasal genetik etkileşim profili oluşturarak, etki mekanizmaları lar ile karşılaştırarak tahmin edilebilirge-ölçekli sentetik genetik ve kimyasal genetik etkileşim 8,9 veri setlerini.
Bileşiklerin puanları, sorguya büyük ölçekli kimyasal-genetik ekranlar, barkod rekabet analizleri ile yapılmıştır. Bu yaklaşımda, silme soylarının havuzlanmış toplama kimyasal içeren, küçük bir ortam hacmi içinde birkaç nesil için topluca yetiştirilir. Her bir kromozom anormalliği mutantı, tek bir genetik barkod barındırır için, silme soylarının havuz içinde tek tek mutantlann canlılığı / büyüme mikrodizi veya yüksek sekanslama 10 tarafından izlenir.
Bir biyolojik olarak aktif bileşiği içeren bir katı agar üzerinde büyütülmüş, fiziksel olarak dizilmiş mutantların kolonilerini izleyerek uygunluk çıkarım da kimyasal bir genetik etkileşimleri 11,12 tanımlamasında çok etkili bir yöntemdir. Bu yaklaşım, rekabete dayalı tarama için maliyet-etkin bir alternatif sunuyor ve kimyasallar küçük kütüphaneler tahlil için uygundur.Burada özetlenen S. kimyasal genetik etkileşimin bir listesini üretmek için bir basit bir yöntemdir biyoloji manipülasyonlar veya altyapı moleküler dayanmaz cerevisiae. Bu sadece bir maya silme koleksiyonu, bir robot veya manuel çivileme aparatı ve serbestçe kullanılabilir görüntü analizi yazılımı gerektirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kimyasal genetik etkileşim profilleri oluşturmak için bir yaklaşım burada özetlenen. yöntem basittir: bir kimyasal maddenin varlığı ve yokluğunda geniş gen silinmesi koleksiyonlarında, her bir suş koloni boyutları karşılaştırarak, bir kimyasal hakaret tolere gerekli genler tespit edilir. Hassas soyların ortaya çıkan listesinin Açıklaması zenginleştirme analizi, daha sonra bir etki kimyasal moduna ilişkin bilgi temin etmek üzere kullanılabilir. Bu protokol, maya tomurcuklanma için optimize e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CJN laboratuarında Araştırma NSERC, Kanada Kanser Derneği Araştırma Enstitüsü (CCSRI) ve Kanada Meme Kanseri Vakfı (BC-Yukon Şubesi) faaliyet hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12 well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
Riferimenti
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
- Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
- Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
- Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
- Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
- Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
- Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
- Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
- Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
- Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
- Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
- Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
- Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
- Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).
