En<em> In Vitro</em> Enzymatisk Assay å måle transkripsjon Hemming av Gallium (III) og H₃ 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Summary

Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole og dens frie basen analogt oppviser lavt mikromolområde celle cytotoksisitet. Dette manuskriptet beskriver en RNA transkripsjon reaksjon, avbildning RNA med en etidiumbromid-farget gel, og kvantifisering av RNA med UV-vis spektroskopi, for å bedømme inhibering av transkripsjon corroles og demonstrerer en grei metode for å vurdere anticancer kandidat egenskaper.

Abstract

Kjemoterapi innebærer ofte bredspektret cytotoksiske midler med mange bivirkninger og begrenset målretting. Corroles er en klasse av tetrapyrrolic makrocykler som viser differensial cytostatiske og cytotoksiske egenskaper i spesifikke cellelinjer, avhengig av identiteten til det chelaterte metall og funksjonelle grupper. Den unike oppførsel av funksjon corroles mot bestemte cellelinjer introduserer muligheten for målrettet kjemoterapi.

Mange anticancer legemidler evalueres ved deres evne til å hemme RNA-transkripsjon. Her presenterer vi en trinn-for-trinn-protokoll for RNA-transkripsjon i nærvær av kjente og potensielle inhibitorer. Evalueringen av RNA-produkter av transkripsjonsreaksjon ved gelelektroforese og UV-vis spektroskopi gir informasjon om inhibitoriske egenskaper av potensielle anticancerlegemiddelkandidater, og med modifikasjoner av analysen, flere om deres virkningsmekanisme.

Litter kjent om den molekylære virkningsmekanismen til corrole cytotoksisitet. I dette forsøket, vi vurdere to corrole forbindelser: gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) og freebase analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Et RNA-transkripsjon assay ble brukt for å undersøke de inhibitoriske egenskaper av corroles. Fem transkripsjonsreaksjoner ble fremstilt: DNA behandlet med Actinomycin D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc ved en [kompleks]: [templat DNA basen] forhold på 0,01, henholdsvis, og en ubehandlet kontrollgruppe.

De transkripsjonsreaksjoner ble analysert etter 4 timer ved hjelp av agarosegel-elektroforese, og UV-vis spektroskopi. Det er klart hemming av Ga (tpfc), Actinomycin D, og ​​triptolide.

Denne RNA-transkripsjon assay kan bli modifisert for å tilveiebringe mer mekanistiske detaljer ved å variere konsentrasjonen av anticancer kompleks, DNA, eller polymerase-enzym, eller ved inkubering av DNA-polymerase eller med komplekserxes før RNA transkripsjon; Disse modifikasjoner vil skille mellom et inhibering mekanisme som involverer DNA, eller enzymet. Tilsetning av komplekset etter RNA-transkripsjon kan brukes til å teste om komplekser brytes ned eller hydrolysere RNA. Denne analysen kan også bli brukt til å studere ytterligere anticancer-kandidater.

Introduction

Kjemoterapi innebærer ofte bredspektret cytotoksiske midler med uønskede bivirkninger og begrenset målretting, men med større forståelse av kreft biologi, det er en stadig økende etterspørsel etter antikreftstoffer med høyere kreft målretting effekt og færre bivirkninger. ^En menneskekreftceller ofte blitt avhengig av en enkelt aktivert eller overuttrykt onkogen for å overleve. ^2. Således er mange anti-cancer medikamenter bedømt ved deres evne til å hemme RNA-transkripsjon. Behandlinger som blokkerer ekspresjonen av disse transformerende gener som er effektive i å eliminere kreft celler, og fører til celledød. ³ Transformerte celler mer følsomme for forstyrrelser i RNA-transkripsjon enn det tilsvarende normale celler. ⁴ anticancer legemidler som hemmer transkripsjon forventes å selektivt inhiberer ekspresjon av onkogener som er nødvendig for kreftcellen for å overleve. ⁵ Følgelig RNA transkripsjon inhibition er en nyttig måte å identifisere potensielle antikreftlegemiddelkandidater og lære mer om deres virkningsmekanisme. Denne protokollen viser at Ga (tpfc) hemmer RNA transkripsjon på samme rekkefølge som kjemoterapi narkotika Actinomycin D og triptolide; tilsvarende sammenligninger kan gjøres ved hjelp av denne protokollen med andre anticancer narkotika kandidater. Actinomycin D er et RNA transkripsjon hemmer vanlig å behandle svangerskaps trophoblastic kreft, testikkelkreft, Wilm tumor, rhabdomyosacoma, og Ewings sarkom ^6. Actinomycin D har vært brukt i kreftbehandling i nesten femti år siden den først ble godkjent av FDA i 1964.Triptolide er en selektiv transkripsjon inhibitor som er undersøkt in vitro og i ulike tumorbærende dyremodeller for 30 år. ⁷

Den amfifil makrocykliske natur corroles formidler betydelige fordeler fremfor andre legemiddelklasser som små molekyler eller biologisks. ^8-14 The makrocykliske karakter tillater cellulær permeabilitet som er større enn forventet for slike store molekyler, og de ​​er store nok til å interagere med makromolekylære overflater, slik som de av proteiner. ⁸ Corroles er kjent for å danne tette ikke-kovalente komplekser med biomolekyler og medikamenter. ¹⁰ I tillegg til den iboende cytotoksisitet av corrole rammeverk, har vi vist at en sulfonert corrole virker som et bærermolekyl for kjemoterapeutiske midler, spesielt DNA-interkalerende antracyklin medikament doksorubicin. Når sulfonatert corrole ble gitt sammen med doxorubicin, ble en tre-fold forbedring i IC ₅₀ av doxorubicin observert for DU-145 celler. ⁹ corrole rammeverket er stabil og har iboende absorbans og fluorescens egenskaper som, når funksjon, gjennomgår unike absorbans skift som kan brukes for karakterisering. ¹⁰ Funksjonalisering av stillaset ikke iboende affect de photophysical egenskapene til corrole, ^9-15, men, sett med en sulfonatert corrole, selektivt å modifisere rammen av corrole kan vesentlig endre sine biologiske egenskaper. ¹⁶ Vi har tidligere evaluert seks metallocorroles mot syv menneskelige kreftcellelinjer. Resultatene indikerer at toksisiteten mot humane kreftceller er avhengig av det spesifikke metallioner, så vel som funksjonelle gruppe substitusjon. For eksempel, sulfonaterte gallium corroles opplevd høy cellulært opptak og trengt selektivt inn i kjernen av hjernemetastatisk prostata kreft celler (DU-145); samme corrole, selv om den ikke trenger inn i kjernen av andre cellelinjer, oppviser større cytotoksisitet for bryst (MDA-MB-231), melanom (SK-MEL-28) og ovarie (OVCAR-3) kreftceller enn for prostatakreft. ⁹

Innledende cellebaserte analyser tyder på at disse forbindelser viser lovende som anti-kreft terapeutiske midler, som fordeler Further etterforskning i virkningsmekanismen. Transkripsjon inhibering observeres med visse metallorganiske komplekser ^17-27, og vi har søkt å undersøke denne prosessen som en mulig mekanisme for den cytotoksiske virkemåten til corrole familien. Dette transkripsjon analysen gir en grei, billig og lettvint metode for å vurdere transkripsjon hemming, som vil føre til mer detaljert informasjon om effektene av disse molekylene i levende celler.

Her transkripsjons inhibering av gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) og dens frie basen analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (figur 1) blir testet. I motsetning til enkelte overgangsmetallkomplekser, (III) er gallium Redox inaktive og er derfor ikke direkte involvert i redoksprosessen redoks-baserte stoffskifte. ²⁸ Uansett, gallium (III) ikke utviser cytotoksiske egenskaper og har blitt undersøkt for terapeutiske formål. Gallium er den nest mest lovende metall for kreftbehandling etter platina og har gjennomgått mange studier og undersøkelser; nitrat og klorid gallium salter har blitt evaluert i kliniske studier mot hepatom, lymfom, blære kreft og andre sykdommer. ^29-34 Gallium (III) er derfor ideell for kreft corrole studier. Innledende data viser Ga (tpfc) og tpfc har lav GI _50, medikamentkonsentrasjon er nødvendig for å hemme 50% av maksimal celleproliferasjon, med forskjellige cancercellelinjer (se figur 2); Dette bekrefter gyldigheten av videre forsøk på disse to forbindelser å bestemme sine inhibitoriske egenskaper. Vi sammenligner disse forbindelsene med de vanligste kreft narkotika Actinomycin D og triptolide. Actinomycin D intercalates DNA, RNA hindrer forlengelse, og induserer apoptose i visse cellelinje ved picomolar konsentrasjoner ^6,35-37 Triptolide har vist seg å hemme tumorvekst.; det binder seg til menneskelig XPB / ERCC3, en underenhet of transkripsjonsfaktor TFIIH, som fører til hemming av RNA polymerase II aktivitet. ^6-7,38-40

Mens det er allment kjent at corroles utviser cytotoksiske egenskaper, det finnes lite informasjon om de ulike mekanismene som oppstår fra funksjon. Corrole hemming av RNA transkripsjon ville gi større innsikt i sine interaksjoner med biomacromolecules. Andre komplekser som er kjent for å binde til DNA, slik som dirhodium (II, II) komplekser, krom (III) -komplekser, ruthenium (II) polypyridyl komplekser, rhodium (III) komplekser, og forskjellige andre, ble underkastet RNA-transkripsjon assays, ^{18- 27} resulterer i større forståelse for deres samhandling med biomacromolecules. Denne lettvinte og allment tilgjengelig eksperimentet er også en god innledende test for å vurdere cytotoksisitets egenskapene til et gitt molekyl og avgjøre om det fortjener ytterligere biologisk testing. RNA-transkripsjon analysen gir også mulighet for mange modifikasjoner, som variasjong mengden av forbindelsen eller enzymer som brukes; variering av inkubasjonstiden, reaksjonstid og prøve tidspunkter; og variering av DNA-templatet lengde og sekvens, blant andre variable av interesse, og dermed potensielt å tilveiebringe en stor mengde data. Dette transkripsjon analysen er også lett tilgjengelig som rimelige sett med alle nødvendige reaksjonskomponentene, selv om komponentene kan kjøpes og forberedt individuelt. I disse eksperimentene, bruker vi en kommersielt tilgjengelig kit kjent for å ha høyt utbytte. ⁴¹

For å vurdere transkripsjon hemming, bruker vi to metoder: agarosegelelektroforese og UV-VIS spektroskopi. Agarose gel elektroforese er en enkel og effektiv metode for å separere, identifisering og rensing av 0,5- til 25-kb DNA- og RNA-fragmenter. ⁴² UV-Vis-spektroskopi kan anvendes for å bestemme konsentrasjonen og renheten av RNA. ⁴³

Protocol

MERK: Når du arbeider med RNA opprettholde et rent arbeidsmiljø for å unngå forurensning av DNase og RNase enzymer som bryter ned DNA og RNA. Sikre at pipettespissene og rør er DNase og RNase gratis. Det er også nyttig å tørke ned lab overflater og utstyr som pipetter, rørholder, etc. med en dekontaminering løsning. 1. RNA transkripsjon med Corrole Treatment Klargjør corrole og inhibitor-forbindelser i et 0,01: 1 molart forhold av [kompleks]: [DNA]. MERK: I vårt…

Representative Results

RNA transkripsjon Kvalitativt Vurdert ved agarosegelelektroforese Agarosegelelektroforese blir brukt til å avbilde transkribert RNA. Etidiumbromid fluoresces ved binding (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46 tillater avbildning av RNA. Mørkere båndene i gelen svarer til høyere konsentrasjoner av RNA. Hvis Actinomycin D, triptolide, eller enten corrole komplekset inhiberer RNA transkripsjon, blir produksjonen av RNA redusert og bande…

Discussion

Denne analysen viser at tilsetningen av Ga (tpfc) hemmer RNA transkripsjon forhold til de kjente DNA-bindende anticancer komplekser Actinomycin D og triptolide. Den cytotoksiske atferd Ga (tpfc) (GI ₅₀ = 58,1 til 154,7 mm) kan på grunn av sin inhibitoriske egenskaper. Siden ingen transkripsjon inhibering ble observert i tpfc, er cytotoksisiteten til tpfc ikke på grunn av RNA-transkripsjon inhibering, men er forårsaket av andre midler, men er ikke undersøkt.

I de fire transkrip…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Actinomycin D	Sigma-Aldrich	A1410	Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide	Sigma-Aldrich	T3652	Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2O	Life Technologies	AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit	Life Technologies	AM1334	Store at –20 °C
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E7637	CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate	Sigma-Aldrich	T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	EDS
UltraPure Agarose	Life Technologies	16500-100
mini Quick Spin RNA Columns	Roche Life Science	11814427001	Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder	New England Biolabs	N3232S	Store at –20 °C