Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.
De productie van recombinante membraaneiwitten voor structurele en functionele studies blijft technisch uitdagend te wijten aan lage niveaus van expressie en de inherente instabiliteit van vele membraaneiwitten eenmaal opgelost in wasmiddelen. Een protocol wordt beschreven dat ligatie onafhankelijke klonen van membraaneiwitten zoals GFP fusies met expressie in Escherichia coli gedetecteerd door GFP fluorescentie combineert. Dit maakt de constructie en expressie screening van meervoudige membraaneiwit / varianten om geschikte kandidaten voor verdere investering van tijd en moeite te identificeren. Het GFP reporter wordt gebruikt in een primaire screening van expressie door visualiseren GFP fluorescentie na SDS-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE). Membraaneiwitten die zowel een hoog expressieniveau met minimale degradatie zien zoals aangegeven door de afwezigheid van vrije GFP, worden geselecteerd voor een tweede scherm. Deze constructen worden geschaald en totaal membraanfractie bereid en solubiliserend vier verschillende detergentia. Volgende ultracentrifuge aan detergent-onoplosbaar materiaal te verwijderen, worden lysaten geanalyseerd met behulp van fluorescentie detectie size exclusion chromatografie (FSEC). Toezicht op de omvang uitsluiting profiel van GFP fluorescentie geeft informatie over de mono-dispersiteitsindex en integriteit van het membraan proteïnen in verschillende reinigingsmiddelen. Eiwit: detergent combinaties die elueren met een symmetrische piek met weinig of geen vrije GFP en minimale aggregatie kandidaat voor verdere zuivering. Met behulp van de bovenstaande methode, de heterologe expressie in E. coli van SED (shape, rek, delen en sporulatie) eiwitten van 47 verschillende soorten bacteriën werd geanalyseerd. Deze eiwitten hebben doorgaans tien transmembraandomeinen en zijn essentieel voor celdeling. De resultaten tonen aan dat de productie van de SED orthologen in E. coli was zeer variabel met betrekking tot de expressieniveaus en de integriteit van de GFP fusie-eiwitten. Het experiment identified een subset voor verder onderzoek.
Er wordt geschat dat membraaneiwitten vertegenwoordigen ongeveer 20-30% van de genen gecodeerde alle gesequenced genomen 1, inclusief het menselijk genoom 2. Gezien hun cruciale rol in vele biologische processen, bijvoorbeeld transport van metabolieten, energieopwekking en als drug targets, is er intense belangstelling voor het bepalen van hun driedimensionale structuur. Maar in vergelijking met oplosbare eiwitten, membraaneiwitten zijn sterk ondervertegenwoordigd in de Protein Data Bank. In feite, van de 99.624 vrijgegeven structuren in het VOB ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) slechts 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) worden geclassificeerd als membraaneiwitten. Dit weerspiegelt de technische problemen van het werken met membraaneiwitten die natuurlijk worden uitgedrukt relatief laag; rhodopsin is een van de weinige uitzonderingen 3,4. Over-expressie van recombinant versies in heterologe cellen resulteert vaak in misfolding en slechte targeting naar het membraan dat het algehele niveau van de productie beperkt. Het selecteren van de beste wasmiddel voor extractie en oplossen van een membraaneiwit eens uitgedrukt maakt daaropvolgende zuivering moeilijk en vereist een zorgvuldige optimalisatie.
Escherichia coli blijft de meest gebruikte expressie gastheer voor membraaneiwitten goed voor 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) structuren opgelost hoogte die bijna uitsluitend zijn uit bacteriële bronnen. Specifieke E. zijn geïsoleerd zijn coli, C41 (DE3) en C43 (DE3), die niet tot de overexpressie van membraaneiwitten en daarmee de effecten van toxiciteit waargenomen voor andere stammen BL21 5,6 vermijden. Afstemmen het niveau van recombinant membraan eiwitexpressie blijkt cruciaal voor het optimaliseren van het productieniveau 6,7 te zijn.
<p class="Jove_content"> Vaak succesvolle productie van membraaneiwitten voor structuurbepaling heeft de evaluatie van meerdere versies zoals amino- en carboxy-eindstandige deleties, verschillende orthologen natuurlijke sequentie variatie en verschillende fusieproteïnen 6-8 benutten vereist. Derhalve is een werkwijze voor de expressie screenen van meerdere membraaneiwitten parallel essentieel. Een algemeen gebruikte benadering is het eiwit groen fluorescerend eiwit (GFP) expressie mogelijk gefixeerd worden gevolgd zonder dat het eiwit te zuiveren. Op deze manier kan informatie over de expressie niveau, stabiliteit en het gedrag in verschillende reinigingsmiddelen worden beoordeeld met kleine hoeveelheden-un gezuiverd materiaal 9-12.In dit artikel beschrijven we een gestroomlijnde protocol voor klonering en expressie screening van membraaneiwitten in E. coli met behulp van fusie aan GFP als verslaggever van de productie en de daaropvolgende karakterisering van wasmiddel: eiwit compinglexes (Figuur 1).
In de in dit artikel beschreven protocol wordt ligatie onafhankelijk kloneren in een GFP reporter vector gecombineerd met fluorescentiedetectie snel screenen van de relatieve expressie van meerdere membraaneiwitten in E. coli. Vectoren kunnen worden gemaakt in vier werkdagen met primaire expressie screening nemen nog een week. In-gel fluorescentie van detergenslysaten van hele cellen wordt gebruikt om te rangschikken expressie raakt voor verdere analyse in een tweede scherm. De primaire uitdrukking scherm zoals gepresenteerd geen specialistische apparatuur, afgezien van een shaker incubator geschikt voor het kweken van cellen in diepe put blokken nodig. Alle andere vloeistofverwerking met 96 putjes SBS platen kunnen worden uitgevoerd met meerkanaals pipetten. Het protocol kan gemakkelijk worden gewijzigd om andere E. coli-stammen onder verschillende expressieomstandigheden (bijvoorbeeld lagere temperatuur) afgeleid omvatten. Bij de LEMO21 (DE3) titreren het niveau van rhamnose (0-2,0 mM)toegevoegd aan de snelheid van de transcriptie te moduleren kan het niveau van expressie van sommige membraaneiwitten 7 te verhogen. Behalve DDM Detergentia kunnen worden voor extractie de primaire screening hoewel zwaardere detergentia eiwitten oplosbaar uit inclusielichamen en dus valse positieven. Duidelijk de uitgebreidere het beginscherm wordt, de tijdrovender het experiment.
De secundaire scherm gaat de voorbereiding van een totaal membraan fractie uit de uitdrukking klappen die in het primaire scherm. Dit is een kritieke stap omdat de lokalisatie van de fusie-eiwitten bevestigt aan het membraan van de E. coli-cellen. Na extractie van de GFP fusie-eiwit in verschillende detergentia wordt gecontroleerd door fluorescentie gedetecteerd gelpermeatiechromatografie van oplosbaar materiaal om de mono-dispersiteit van het detergens-eiwitcomplexen beoordelen. Dit is weer een belangrijke stap omdat het identificeert de meest geschikte reinigingsmiddel voorsolubilisatie van het membraaneiwit voor verdere stroomafwaartse bewerking. De ervaring leert echter dat een verdere optimalisering van de keuze van het wasmiddel (s) nog steeds tijdens de zuivering en kristallisatie kan worden verlangd. Bewijs van uniform gedrag in verschillende detergentia waaronder degenen met een relatief kleine micel formaat (bijv LDAO) lijkt een goede indicator van een neiging om goed vorm buigen van kristallen althans prokaryotische membraaneiwitten 14 zijn. In dit opzicht blijkt het membraaneiwit in figuur 2B profiel beschikking zeer gunstig.
Het belangrijkste voordeel van het gebruik van een GFP reporter is dat het geeft een snelle uitlezing van meningsuiting in-un gezuiverd monsters. Een nadeel is dat de GFP fusie-eiwit tijdens de zuivering van het eiwit kristallisatie te verwijderen. In het geval van de vectoren hier gebruikt, een rhinovirus 3C protease website geeft splitsing van het GFP. Alternatief is eenvoudigaan kandidaat-eiwitten, die in het scherm-kloon opnieuw in vectoren die slechts een polyhistidine of andere affiniteit tag toe te voegen voor de volgende zuivering. Dit veronderstelt dat fusie aan GFP niet noodzakelijk voor expressie. De belangrijkste alternatief voor fusie aan GFP voor detectie van membraaneiwit expressie en oplosbaar is slechts een histidine tag. Deze benadering vereist echter gewoonlijk vanaf een membraanfractie 15 die voor de evaluatie van vele varianten zeer tijdrovend zou worden.
Samengevat, het belangrijkste doel van de in dit artikel beschreven protocol is het mogelijk een groot aantal membraaneiwit sequentievarianten snel worden geëvalueerd in termen van meningsuiting en wasmiddel oplosbaar en geprioriteerd voor diepere analyse.
The authors have nothing to disclose.
The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).
Name of Material | Company | Catalog Number |
pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/ | 60444-1 |
LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H |
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 |
Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 |
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 |
Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 |
CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 |
DDM ( n-Dodecyl ß-maltoside ) | Generon | D97002 |
DM (n-Decyl ß-maltoside) | Generon | D99003 |
LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 |
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul | Thermo Scientific | 4672030 |
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200µL LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS |
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20µL LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS |
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200µL LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS |
24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 |
BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 |
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX |
XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 |
Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 |
Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 |
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 |
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 |
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 |
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | |
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs | Shel Lab | SSI5R-HS |
Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R |
TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI) | Constant systems | PL083016 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |