En rationaliserad strategi för screening för uttryck av rekombinanta membranproteiner i Escherichia coli baserat på fusion till grönt fluorescerande protein presenteras.
Produktionen av rekombinanta membranproteiner för strukturella och funktionella studier förblir tekniskt utmanande på grund av låga nivåer av uttryck och den inneboende instabilitet många membranproteiner gång löses i tvättmedel. Ett protokoll beskrivs som kombinerar tion oberoende kloning av membranproteiner som GFP fusioner med uttryck i Escherichia coli som upptäckts av GFP fluorescens. Detta möjliggör konstruktion och uttryck screening av flera membranprotein / varianter att identifiera sökande som är lämpliga för vidare investering i tid och ansträngning. GFP reporter används i en primär screening av expression genom att visualisera GFP fluorescens efter SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE). Membranproteiner som visar både en hög expressionsnivå med minimal nedbrytning såsom indikeras genom frånvaro av fritt GFP, väljs ut för en sekundär screening. Dessa konstruktioner skalas och totalt membranfraktion beredd och lösad i fyra olika tvättmedel. Efter ultracentrifuge att avlägsna tvättmedel-olösligt material, är lysat analyseras med fluorescensdetektion storleksuteslutningskromatografi (FSEC). Övervakning av storleksuteslutnings profilen genom GFP fluorescens ger information om mono-dispersiteten och integritet membranproteiner i olika tvättmedel. Protein: kombinationer rengöringsmedel som elueras med en symmetrisk topp med liten eller ingen fri GFP och minimal aggregation är kandidater för efterföljande rening. Med hjälp av denna metod, den heterologa uttryck i E. coli i SED (form, töjning, division, och sporulering) proteiner från 47 olika arter av bakterier analyserades. Dessa proteiner har normalt tio transmembrandomäner och är essentiella för celldelning. Resultaten visar att produktionen av SEDS ortologer i E. coli var mycket varierande med avseende på expressionsnivåerna och integriteten hos de GFP fusionsproteiner. Experimentet identified en delmängd för vidare undersökning.
Det har uppskattats att membranproteiner svarar för cirka 20-30% av de gener kodade i alla sekvenserade genom en, inklusive det mänskliga genomet 2. Med tanke på deras avgörande roll i många biologiska processer, exempelvis transport av metaboliter, energiproduktion och som läkemedelsmål, det finns stort intresse i att bestämma deras tredimensionella struktur. Men jämfört med lösliga proteiner, membranproteiner är mycket underrepresenterade i Protein Data Bank. Faktum av de 99.624 släppt strukturer i det preliminära budgetförslaget ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) Endast 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) klassificeras som membranproteiner. Detta återspeglar de tekniska svårigheterna med att arbeta med membranproteiner som är naturligt uttrycks på relativt låga nivåer; rodopsin är en av några få undantag 3,4. Överuttryck av rekombinant versionsi heterologa celler resulterar ofta i felveckning och dålig inriktning till membranet som begränsar den totala produktionsnivån. Välja den bästa rengöringsmedel för utvinning och upplösning av ett membranprotein gång uttryckt gör efterföljande rening svårt och kräver noggrann optimering.
Escherichia coli är fortfarande den mest använda expressionsvärd för membranproteiner som svarar för 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) av strukturer löste hittills som är nästan uteslutande från bakteriella källor. Specifik E. coli-stammar, C41 (DE3) och C43 (DE3), har isolerats som inte leder till överuttryck av membranproteiner och därmed undvika effekterna av toxicitet observerats för andra BL21 stammar 5,6. Tuning nivån av rekombinant membranproteinuttryck verkar vara avgörande för att optimera produktionsnivån 6,7.
<p class="Jove_content"> I många fall framgångsrik produktion av membranproteiner för strukturbestämning har krävt en utvärdering av flera versioner inklusive amino- och karboxiterminala deletioner, flera ortologer att utnyttja naturliga sekvensvariation och olika fusionsproteiner 6-8. Därför är det viktigt med en metod för expression screening av multipla membranproteiner parallellt. En vanligen använd metod är att fusera proteinet till grönt fluorescerande protein (GFP) som möjliggör uttryck som ska spåras utan behovet att rena proteinet. På så sätt kan information om uttrycksnivå, stabilitet och beteende i olika tvättmedel bedömas med små mängder un-renat material 9-12.I den här artikeln beskriver vi en strömlinjeformad protokoll för kloning och uttryck screening av membranproteiner i E. coli använder fusion till GFP som reporter för produktion och efterföljande karakterisering av tvättmedel: protein complexes (Figur 1).
I det protokoll som beskrivs i den här artikeln, är ligation oberoende kloning i en GFP reporter vektor kombination med fluorescensdetektion för att snabbt screena det relativa uttrycket av flera membranproteiner i E. coli. Vektorer kan göras i fyra arbetsdagar med primär uttryck screening tar ytterligare en vecka. I-gel fluorescens av detergentlysat av hela celler används för att rangordna uttryck träffar för vidare analys i en sekundär skärm. Den primära expressions skärm som presenteras inte kräver någon specialutrustning förutom en skakinkubator lämplig för odling av celler i djupa well block. Alla andra vätskehanterande involverar 96-brunnars SBS plattorna kan utföras med användning av multikanalpipetter. Protokollet kan lätt ändras för att inkludera andra E. coli-stammar odlas under olika uttrycksförhållanden (t.ex. lägre temperatur). I fallet med den LEMO21 (DE3) titrering av den nivå av ramnos (0-2,0 mM)tillsatt modulera transkriptionshastigheten kan öka nivån av uttryck av vissa membranproteiner 7. Andra än DDM Rengöringsmedel kan användas för utvinning i den primära skärmen men hårdare tvättmedel kan lösa proteiner från inklusionskroppar och därmed ge falska positiva. Tydligt, desto mer utarbeta startskärmen blir, desto mer tidskrävande experimentet.
Den sekundära skärm innebär förbereder en total membranfraktion från uttrycket hits som identifierats i den primära skärmen. Detta är ett kritiskt steg eftersom det kommer att bekräfta lokaliseringen av fusionsproteinerna till membranet av E. coli-celler. Efterföljande extraktion av GFP-fusionsproteinet i olika detergenter övervakas genom fluorescens-detekterad storleksuteslutningskromatografi av solubiliserade materialet för att bedöma mono-dispersitet av detergent-protein-komplex. Detta är ytterligare ett viktigt steg eftersom det identifierar den mest lämpliga tvättmedel försolubilisering av membranprotein för efterföljande nedströms bearbetning. Erfarenheten visar dock att ytterligare optimering av valet av tvättmedel (s) fortfarande kan krävas under rening och kristallisering. Bevis på enhetligt beteende i olika rengöringsmedel inklusive de med en relativt liten micell storlek (t.ex. LDAO) verkar vara bra indikator på en benägenhet att bilda väl brytande kristaller åtminstone för prokaryota membranproteiner 14. I detta avseende den profil som visas för membranprotein i figur 2B visas mycket god.
Den främsta fördelen med att använda en GFP reporter är att den ger en snabb avläsning av uttryck i un-renade prover. En nackdel är att GFP fusionsproteinet måste avlägsnas under reningen av proteinet för kristallisation. I fallet med de vektorer som används här, en rhinovirus 3C proteasstället möjliggör klyvning av GFP. Alternativt är det okompliceratatt åter-klon kandidatproteiner, som identifierats i skärmen, i vektorer som bara lägger ett polyhistidin eller annan affinitetsmarkör för efterföljande rening. Detta förutsätter att fusion till GFP är inte nödvändigt för uttryck. Huvud alternativ till att använda fusion till GFP för detektion av membranproteinuttryck och solubiliseringen är att lägga bara histidinmärkning. Emellertid detta tillvägagångssätt kräver typiskt börjar med en membranfraktion 15, som för utvärdering av många varianter skulle bli mycket tidskrävande.
Sammanfattningsvis är det huvudsakliga syftet med det protokoll som beskrivs i den här artikeln för att möjliggöra ett stort antal membranprotein sekvensvarianter att snabbt utvärderas vad gäller uttryck och tvättmedel lösningsgörande och prioriteras för djupare analys.
The authors have nothing to disclose.
The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).
Name of Material | Company | Catalog Number |
pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/ | 60444-1 |
LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H |
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 |
Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 |
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 |
Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 |
CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 |
DDM ( n-Dodecyl ß-maltoside ) | Generon | D97002 |
DM (n-Decyl ß-maltoside) | Generon | D99003 |
LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 |
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul | Thermo Scientific | 4672030 |
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200µL LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS |
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20µL LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS |
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200µL LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS |
24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 |
BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 |
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX |
XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 |
Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 |
Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 |
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 |
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 |
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 |
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | |
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs | Shel Lab | SSI5R-HS |
Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R |
TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI) | Constant systems | PL083016 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |