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Neuroscienze

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

Published: January 10, 2015
doi:
10.3791/52358
, ,
1Institute of Neuroscience and Medicine (INM-2),Research Centre Jülich, 2Department of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical Faculty, JARA,RWTH Aachen University

Summary

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Abstract

동시에 세포 내 biocytin 충전 급성 뇌 조각 준비에 두 개 (또는 그 이상)의 시냅스 결합 뉴런 (쌍 녹음)에서 패치 클램프 녹음의 조합은 구조적 및 기능적 특성의 상관 분석을 할 수 있습니다. 이 방법으로 그들의 형태 및 전기 생리 학적 반응 패턴에 의해 모두 사전 및 시냅스 후 뉴런을 식별하고 특성화 할 수있다. 쌍으로 녹음이 뉴런 사이의 연결 패턴뿐만 아니라 모두 화학 및 전기 시냅스 전송의 특성을 연구 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 신경 세포 형태의 최적의 복구와 함께 안정적인 페어링 녹화를 얻기 위해 필요한 절차를 단계별로 설명을 제공한다. 우리는 화학적 시냅스 또는 갭 접합을 통해 연결된 뉴런의 쌍 뇌 슬라이스 준비에서 확인하는 방법을 설명합니다. 우리는 뉴런 dendrit 그들의 3 차원 형태를 얻기 위해 재구성 방법을 간략하게 설명 할 것이다IC와 축삭 도메인과 방법 연접 식별 및 지역화됩니다. 우리는 또한 특히 뇌 조각의 준비 기간 동안 수지상 축삭 잘림과 관련된 사람들은이 강하게 연결 추정 영향을 미치므로, 한 쌍의 기록 기술의주의 사항 및 제한 사항에 대해 설명합니다. 그러나, 한 쌍의 기록 방법의 다양성으로는 뇌에서 확인 된 신경 세포의 미세 회로에서 시냅스 전달의 다양한 측면을 특성화에 유용한 도구로 유지됩니다.

Introduction

두 개의 뉴런 사이의 시냅스 결합 미소 신경은 뇌에서 대규모 네트워크의 구성 블록과 시냅스 정보 처리의 기본 단위이다. 이러한 신경 미세 회로의 특성을위한 전제 조건은 형태학 및 사전 및 시냅스 후 뉴런 파트너 모두의 기능적 특성, 시냅스 연결 (들) 및 그 구조 및 기능적 메커니즘의 유형을 아는 것이다. 그러나 시냅스 연결의 많은 연구에 저항기의 뉴런의 적어도 하나의 특징이 잘되지 않는다. 이것은 종종 시냅스 연결의 연구에 사용 비교적 비특이적 자극 프로토콜의 결과. 따라서 시냅스 전 뉴런의 구조적 및 기능적 특성은 모두 하나 또는 단지 약간 작은 정도로 식별되지 않은 (즉, 마커 단백질의 발현 등). 마커들에 의해 세포 내 염색과 함께 짝을 녹음biocytin, neurobiotin 또는 형광 염료 UCH는 작은 신경 세포의 미세 회로를 공부에 더 적합하다. 이 기술은 사람이 동시에 형태학 식별 시냅스 연결의 구조적 및 기능적 많은 파라미터를 조사 할 수있다.

두 개의 뉴런 사이의 소위 '단일'monosynaptic 연결은 급성 슬라이스 준비를 사용하여 두 피질 및 피질 뇌 영역 1-10 조사되었다. 먼저, 날카로운 미소 전극은 이들 실험에 사용 하였다; 이상, 패치 클램프 기록은 낮은 잡음 레벨과 시간 해상도 개선과 시냅스 신호들의 기록을 얻기 위해 사용 하였다.

중요한 기술적 진보는 적외선 미분 간섭 대비 (IR-DIC) 광학 11-14, 크게는 수 t이되도록 뇌 조각에서 뉴런의 가시성과 인식을 개선 현미경 기술을 사용했다O를 시각적으로 확인 된 시냅스 연결 15-17에서 녹음을 구하십시오. 일반적으로 짝을 녹음 급성 슬라이스 준비에서 수행된다 매우 소수의 출판물은 생체 18-20에서 시냅스 연결 뉴런에서 사용할보고 기록이다.

페어링 레코딩의 가장 중요한 장점은, 기능적 특성은 광학 및 전자 현미경 수준 모두에서 형태 학적 분석과 결합 될 수 있다는 사실이다 (참조 예., 7,16,21). 조직 화학적 처리 후 시냅스 신경 접속 쌍의 축삭 돌기 형태가 추적된다. 이어서, 이들 변수는 다음 특정 시냅스 연결의 대물 분류 기준을 제공 할 수있다 등의 길이, 공간적 밀도, 방향 분지 패턴 형태 적 특징을 정량화 할 수있다. 또한, 접속 .. 신경 연구를위한 다른 기술이 사용되는 대부분 대조적vity, 쌍 기록은 단일 시냅스 연결을위한 연접의 식별을 허용합니다. 이는 광학 및 전자 현미경 16,21-27의 조합을 이용하거나 돌기 쪽의 칼슘을 사용하여 28, 29 촬상 직접 행해질 수있다. 그러나, 후자의 접근 방식 만 아니라 흥분 억제 성 연결이 연구 될 수 그것이 시냅스 후 수용체 채널을 통해 칼슘 유입을 필요로.

정의 신경 저항기 쌍의 녹화에서 시냅스 전달의 상세한 분석 외에도 시냅스 규칙 (30, 31)의 조사를 허용 또는 – 아세틸 콜린 (32) 및 아데노신과 같은 신경 전달 물질에 의해 시냅스 전달의 조절 – 작용제 / 길항제 애플리케이션과 함께 (33).

Protocol

모든 실험 절차는 동물의 보호, 독일의 동물 복지법에 대한 EU 지침 (Tierschutzgesetz)과 유럽 실험 동물 학회의 연맹의 지침에 따라 수행되고있다. 전기 생리학 1. 셋업 한 쌍의 기록으로 시작하기 전에, 전기 생리학 설정 내장되어야한다. 이러한 셋업은 아래와 같습니다 조립 방법에 대한 간략한 개요 : 현미경, 매니퓰레이터와 모든 다른 장비가 배?…

Representative Results

짝 기록은 형태 학적으로 확인 된 대학 또는 양방향 시냅스 연결에 대한 심도있는 특성에 대한 선택의 방법뿐만 아니라 간극 결합 (전기) 연결 (그림 1)입니다. 체성 감각 피질 배럴의 층 (4)에 한 쌍의 기록의 예는도 1a에 도시된다. 단방향 흥분성과 억제 성 시냅스 연결 둘 다 (그림 1B, C)을 특징으로 할 수있다. 또한 짝을 녹음 한 쌍의 두 신경 사전 및 서로 연?…

Discussion

시냅스 결합 흥분성 및 / 또는 억제 뉴런에서 짝 기록은 신경 세포의 미세 회로의 연구에 매우 다양한 접근 방법이다. 뿐만 아니라, 이러한 접근 방식은 하나의 신경 세포 유형 간 시냅스 연결을 추정 할 수 있도록 할뿐만 아니라 연결 및 사전 및 시냅스 후 뉴런의 형태의 기능적 특성을 결정 허용 않는다. 또한, 작용제 및 / 또는 길항제 쉽게 슬라이스 제제 뉴런에 적용될 수있다. 이것은 하나의 예?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank all members of ‘Function of Neuronal Microcircuits’ Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre Jülich and the ‘Function of Cortical Microcircuits’ Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier HEKA EPC 10 USB Triple with 2-3 preamplifiers
Microscope Olympus BX51WI with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective
Camera TILL Photonics VX55 infrared CCD camera
Workstation Luigs & Neumann Infrapatch 240 with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator Luigs & Neumann SM-5 x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers
Faraday cage Luigs & Neumann
Anti-vibration table Newport Spectra-Physics
Patchmaster HEKA
Microtome Microm International HM650V
Micropipette puller HEKA Sutter P-97
Neurolucida system Microbrightfield with Neurolucida and Neuroexplorer softwares
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Keywords: Paired Patch-clamp RecordingAcute Brain SliceNeuronal MicrocircuitsSynaptic TransmissionElectrophysiologyMorphologyConnectivityChemical SynapsesGap JunctionsNeuron ReconstructionDendritic TruncationAxonal Truncation
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Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358, doi:10.3791/52358 (2015).
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