JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Neuroscienze

Elektrofysiologiske og morfologiske karakterisering af neuronal Mikrokredsløb i akut Brain Skiver Brug parrede Patch-clamp optagelser

Published: January 10, 2015
doi:
10.3791/52358
, ,
1Institute of Neuroscience and Medicine (INM-2),Research Centre Jülich, 2Department of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical Faculty, JARA,RWTH Aachen University

Summary

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Abstract

Kombinationen af ​​patch clamp optagelser fra to (eller flere) synaptisk koblede neuroner (parrede optagelser) i akutte præparater hjernen skive med samtidig intracellulær biocytin fyldning giver en korreleret analyse af deres strukturelle og funktionelle egenskaber. Med denne metode er det muligt at identificere og karakterisere både præ- og postsynaptiske neuroner ved deres morfologi og elektrofysiologiske respons mønster. Forbundne optagelser tillader studere tilslutningsmuligheder mønstre mellem disse neuroner samt egenskaber både kemisk og elektrisk synaptisk transmission. Her giver vi et trin-for-trin beskrivelse af de procedurer, der er nødvendige for at opnå pålidelige parrede optagelser sammen med en optimal genvinding af neuron morfologi. Vi vil beskrive, hvordan par af neuroner forbundet via kemiske synapser eller gap junctions er identificeret i hjernen skive præparater. Vi vil skitsere, hvordan neuroner rekonstrueres for at få deres 3D-morfologi dendritic og aksonal domæne og hvordan synaptisk kontakter identificeres og lokaliseres. Vi vil også drøfte de forbehold og begrænsninger den parrede optagelse teknik, især dem der er forbundet med dendritiske og axonale trunkeringer under udarbejdelsen af ​​hjerneskiver fordi disse stærkt påvirke tilslutningsmuligheder skøn. Men på grund af alsidigheden af ​​den parrede optagelse tilgang vil det fortsat være et værdifuldt værktøj til at karakterisere forskellige aspekter af synaptisk transmission på identificerede neuronale mikrokredsløb i hjernen.

Introduction

Neuronale mikrokredsløb mellem to synaptisk sammenkoblede neuroner er byggestenene i store netværk i hjernen og er de grundlæggende enheder af synaptisk informationsbehandling. En forudsætning for karakterisering af sådanne neuronale mikrokredsløb er at kende morfologi og funktionelle egenskaber af både for- og postsynaptiske partner neuroner, typen af den synaptiske forbindelse (r) og dets struktur og funktionelle mekanisme. Men i mange studier af synaptiske forbindelser mindst en af ​​de neuroner i et mikrokredsløb er ikke godt karakteriseret. Dette skyldes de relativt uspecifikke stimulationsregimer ofte bruges i studier af synaptisk forbindelse. Derfor de strukturelle og funktionelle egenskaber af den præsynaptiske neuron enten ikke identificeres på alle eller kun en forholdsvis lille udstrækning (dvs. ekspressionen af markørproteiner etc.). Forbundne optagelser i kombination med intracellulær farvning af markører such som biocytin, neurobiotin eller fluorescerende farvestoffer er bedre egnet til at studere små neuronale mikrokredsløb. Denne teknik gør det muligt at undersøge mange strukturelle og funktionelle parametre for en morfologisk identificerede synaptisk forbindelse på samme tid.

De såkaldte "enhedsstat" monosynaptiske forbindelser mellem to neuroner er blevet undersøgt i både subkortikale hjerneområder 1-10 ved hjælp akutte præparater skive. Oprindeligt blev skarpe mikroelektroder anvendt i disse eksperimenter; senere blev patch clamp optagelse ansat for at opnå optagelser af synaptiske signaler med et lavere støjniveau og en forbedret tidsopløsning.

En væsentlig teknisk fremskridt var brugen af infrarøde differential interferens kontrast (IR-DIC) optik 11-14, en mikroskopisk teknik, væsentligt forbedret synligheden og identifikation af neuroner i hjernen skive, så det blev muligt to få optagelser fra visuelt identificeret synaptiske forbindelser 15-17. I almindelighed er parrede optagelser udført i akutte præparater slice; kun meget få publikationer er tilgængelige rapportering optagelser fra synaptisk forbundne neuroner in vivo 18-20.

Den vigtigste fordel ved parrede optagelser er, at en funktionel karakterisering kan kombineres med en morfologisk analyse på både lys- og elektronmikroskopiske niveau (se f.eks., 7,16,21). Efter histokemisk behandling, er den dendritiske og axonal morfologi synaptisk forbundet neuron par spores. Efterfølgende er det muligt at kvantificere morfologiske træk såsom længde, fysisk tæthed, orientering, forgrening mønster etc. Disse parametre kan så danne grundlag for en objektiv klassificering af en specifik synaptisk forbindelse. Derudover, i modsætning til de fleste andre teknikker, der anvendes til at studere neuronale connectivity, parret optagelser tillader også identifikation af synaptiske kontakter om ensartet synaptiske forbindelser. Dette kan gøres direkte ved hjælp af en kombination af lys og elektronmikroskopi 16,21-27 eller ved hjælp af calcium billeddannelse 28,29 af dendritiske Torner. Men med den sidstnævnte fremgangsmåde kun excitatoriske men ikke hæmmende forbindelser kan studeres, da det kræver calciumindstrømning via postsynaptiske receptor-kanaler.

Ud over en detaljeret analyse af synaptisk transmission ved en defineret neuronale mikrokredsløb parret optagelser også give studiet af synaptisk plasticitet regler 30,31 eller – i kombination med agonist / antagonist ansøgning – modulering af synaptisk transmission af neurotransmittere, såsom acetylcholin 32 og adenosin 33.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer er udført i overensstemmelse med EU-direktivet om beskyttelse af dyr, den tyske dyreværnsloven (Tierschutzgesetz) og retningslinjerne fra Federation of European Laboratory Animal Science Association. 1. Set-up for Elektrofysiologi Før man starter med parret optagelse, en elektrofysiologi set-up skal bygges. En kort beskrivelse, hvordan en sådan opsætning er samlet er angivet nedenfor: Installer et anti-vibration bor…

Representative Results

Forbundne optagelser er den foretrukne metode til en grundig karakterisering af morfologisk identificerede ensrettede eller gensidige synaptiske forbindelser samt gap junction (elektriske) forbindelser (figur 1). Et eksempel på et parret optagelse i lag 4 af somatosensoriske tønde cortex, er vist i figur 1A. Både ensrettet excitatoriske og inhibitoriske synaptiske forbindelser kan karakteriseres (figur 1B, C). Endvidere parrede optagelser muligt at optage fra tovejs …

Discussion

Forbundne optagelser fra synaptisk koblet excitatoriske og / eller hæmmende neuroner er en meget alsidig fremgangsmåde til undersøgelse af neuronale mikrokredsløb. Ikke alene denne fremgangsmåde, at man kan estimere synaptisk forbindelse mellem neuron typer, men også gør det muligt at bestemme de funktionelle egenskaber af forbindelsen og morfologi præ- og postsynaptiske neuroner. Endvidere kan agonist og / eller antagonist let anvendes til neuroner i slice præparater. Dette gør det muligt at undersøge virkni…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank all members of ‘Function of Neuronal Microcircuits’ Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre Jülich and the ‘Function of Cortical Microcircuits’ Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier HEKA EPC 10 USB Triple with 2-3 preamplifiers
Microscope Olympus BX51WI with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective
Camera TILL Photonics VX55 infrared CCD camera
Workstation Luigs & Neumann Infrapatch 240 with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator Luigs & Neumann SM-5 x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers
Faraday cage Luigs & Neumann
Anti-vibration table Newport Spectra-Physics
Patchmaster HEKA
Microtome Microm International HM650V
Micropipette puller HEKA Sutter P-97
Neurolucida system Microbrightfield with Neurolucida and Neuroexplorer softwares
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
  2. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
  3. Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
  4. Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
  5. Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
  6. Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. Neuroscienze. 54 (2), 329-346 (1993).
  7. Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
  8. Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
  9. Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
  10. Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
  11. MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
  12. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  13. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  14. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
  15. Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
  16. Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
  17. Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
  18. Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
  19. Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
  20. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
  21. Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
  22. Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
  23. Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
  24. Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
  25. Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
  26. Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
  27. Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
  28. Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
  29. Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
  30. Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
  31. Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
  32. Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
  33. Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. . Society for Neuroscience. , 335.313 (2012).
  34. Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D., Fellin, T., Halassa, M. . Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. 67, 405-431 (2012).
  35. Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single ‘barrel’ of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
  36. Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
  37. Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  38. Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
  39. Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
  40. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
  41. Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
  42. Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
  43. Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
  44. Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
  45. Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
  46. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  47. Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
  48. Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
  49. Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382 (2006).
  50. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
  51. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  52. Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
  53. Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
  54. Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
  55. Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
  56. Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
  57. Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).

Tags

Paired Patch-clamp RecordingAcute Brain SliceNeuronal MicrocircuitsSynaptic TransmissionElectrophysiologyMorphologyConnectivityChemical SynapsesGap JunctionsNeuron ReconstructionDendritic TruncationAxonal Truncation
check_url/it/52358?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358, doi:10.3791/52358 (2015).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image