Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

Summary

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Abstract

La combinaison d'enregistrements patch clamp de deux (ou plus) des synapses des neurones couplés (enregistrements appariés) dans aiguës préparations de tranches de cerveau avec remplissage simultané de la biocytine intracellulaire permet une analyse corrélée de leurs propriétés structurales et fonctionnelles. Avec cette méthode, il est possible d'identifier et de caractériser les neurones pré- et post-synaptiques par leur morphologie et leur profil de réponse électrophysiologique. Enregistrements appariés permettent l'étude des modes de connectivité entre ces neurones ainsi que les propriétés à la fois la transmission synaptique chimique et électrique. Ici, nous donnons une description étape par étape des procédures requises pour obtenir des enregistrements appariés fiables avec une récupération optimale de la morphologie des neurones. Nous allons décrire comment paires de neurones connectés via les synapses chimiques ou de jonctions lacunaires sont identifiés dans les préparations de tranches de cerveau. Nous allons exposer comment les neurones sont reconstruits pour obtenir leur morphologie 3D de la Dendritic et le domaine axonale et comment contacts synaptique sont identifiés et localisés. Nous discuterons également les mises en garde et les limites de la technique d'enregistrement couplé, en particulier ceux associés à troncatures dendritiques et axonales lors de la préparation des tranches de cerveau parce que ces affectent fortement les estimations de connectivité. Toutefois, en raison de la polyvalence de l'approche d'enregistrement jumelé il restera un outil précieux pour caractériser les différents aspects de la transmission synaptique au microcircuits neuronaux identifiés dans le cerveau.

Introduction

Microcircuits neuronaux entre deux neurones synaptiquement couplés sont les blocs de construction de réseaux à grande échelle dans le cerveau et sont les unités fondamentales de synaptique traitement de l'information. Une condition préalable pour la caractérisation de ces microcircuits neuronaux est de connaître la morphologie et les propriétés fonctionnelles des deux partenaires neurones pré- et post-synaptiques, le type de la connexion synaptique (s) et sa structure et son mécanisme fonctionnel. Cependant, dans de nombreuses études de connexions synaptiques au moins l'un des neurones dans un microcircuit ne est pas bien caractérisé. Il en résulte des protocoles de stimulation relativement non spécifiques souvent utilisées dans les études de la connectivité synaptique. Par conséquent, les propriétés structurelles et fonctionnelles du neurone présynaptique sont identifiées soit pas du tout ou seulement dans une mesure relativement faible (par exemple, l'expression des protéines marqueurs, etc.). Enregistrements appariés en combinaison avec coloration intracellulaire de marqueurs sUCH que biocytine, neurobiotin ou colorants fluorescents sont mieux adaptés pour l'étude de petites microcircuits neuronaux. Cette technique permet d'enquêter sur de nombreux paramètres structurels et fonctionnels d'une connexion synaptique identifiée morphologiquement en même temps.

Les soi-disant connexions monosynaptiques «unitaire» entre deux neurones ont été étudiés dans les deux régions corticales et sous-corticales du cerveau ^1-10 utilisant des préparations de tranche aigus. Initialement, microélectrodes tranchants ont été utilisés dans ces expériences; plus tard, l'enregistrement patch clamp a été utilisée pour obtenir des enregistrements de signaux synaptiques avec un niveau de bruit inférieur et une résolution temporelle améliorée.

Un progrès technique important est l'utilisation de contraste d'interférence différentiel à infrarouges (IR-DIC) ^14.11 optique, une technique microscopique qui améliore considérablement la visibilité et l'identification des neurones dans la tranche de cerveau de sorte qu'il devient possible to obtenir des enregistrements de connexions synaptiques identifiés visuellement ^15-17. En général, les enregistrements appariés sont effectuées dans des préparations de tranche aigus; que très peu de publications sont disponibles enregistrements de rapports de neurones reliés par des synapses in vivo ^18-20.

L'avantage le plus important d'enregistrements appariés est le fait qu'une caractérisation fonctionnelle peut être combiné avec une analyse morphologique à la fois la lumière et de l'électron niveau microscopique (voir, par exemple., ^7,16,21). Après le traitement histochimique, la morphologie dendritique et axonale de la paire de neurones reliés par des synapses est tracée. Par la suite, il est possible de quantifier les caractéristiques morphologiques telles que la longueur, la densité spatiale, l'orientation, patron de ramification, etc. Ces paramètres peuvent alors fournir une base pour une classification objective d'une connexion synaptique spécifique. En outre, contrairement à la plupart des autres techniques utilisées pour l'étude de rappro neuronalestivité, jumelé enregistrements permettent également l'identification des contacts synaptiques pour les connexions synaptiques unitaires. Cela peut être fait directement à l'aide d'une combinaison de microscopie optique et électronique ^16,21-27 ou en utilisant l'imagerie calcique ^28,29 des épines dendritiques. Toutefois, cette dernière approche ne excitateur mais pas des connexions inhibitrices peuvent être étudiés car elle nécessite l'influx de calcium par les canaux des récepteurs post-synaptiques.

En plus d'une analyse détaillée de la transmission synaptique chez un microcircuit couplé enregistrements neuronaux définies permettent également l'étude des règles de plasticité synaptique ^30,31 ou – en combinaison avec une application agoniste / antagoniste – la modulation de la transmission synaptique par les neurotransmetteurs tels que l'acétylcholine et de l'adénosine ^{32 33.}

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec la directive de l'UE pour la protection des animaux, la Loi sur la protection des animaux allemand (Tierschutzgesetz) et les lignes directrices de la Fédération de l'Association européenne des sciences des animaux de laboratoire. 1. Mise en place d'électrophysiologie Avant de commencer avec enregistrement jumelé, un électrophysiologie set-up doit être construit. Un b…

Representative Results

Enregistrements liés sont la méthode de choix pour une caractérisation approfondie des connexions synaptiques uni ou bidirectionnels morphologiquement identifiées ainsi que jonctions lacunaires connexions (électriques) (Figure 1). Un exemple d'un enregistrement couplé à la couche 4 du cortex somato-sensoriel du canon est représentée sur la Figure 1A. Les deux excitateurs unidirectionnel et connexions synaptiques inhibiteurs peuvent être caractérisées (figure 1B, …

Discussion

Enregistrements appariés de excitateur synaptiquement couplé et / ou neurones inhibiteurs sont une approche très polyvalent pour l'étude de microcircuits neuronaux. Non seulement cette approche permet d'estimer la connectivité synaptique entre les types de neurones, mais permet également de déterminer les caractéristiques fonctionnelles de la connexion et de la morphologie des neurones pré- et post-synaptiques. En outre, un agoniste et / ou antagoniste peuvent être facilement appliqués à des neurones…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA	EPC 10 USB Triple	with 2-3 preamplifiers
Microscope	Olympus	BX51WI	with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective
Camera	TILL Photonics	VX55	infrared CCD camera
Workstation	Luigs & Neumann	Infrapatch 240	with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5	x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers
Faraday cage	Luigs & Neumann
Anti-vibration table	Newport Spectra-Physics
Patchmaster	HEKA
Microtome	Microm International	HM650V
Micropipette puller	HEKA	Sutter P-97
Neurolucida system	Microbrightfield		with Neurolucida and Neuroexplorer softwares