A-crítico tamaño femoral Defecto sencillo modelo en ratones

Summary

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Abstract

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility.

Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.

Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Introduction

Se estima que la mitad de la población de Estados Unidos experimenta una fractura por la edad de 65 años ^1. Para los pacientes con fracturas tratadas quirúrgicamente, 500.000 procedimientos implican el uso de un injerto de hueso ² y se espera que esta cifra aumente con una población cada vez más envejecida ³ . Aunque el hueso es uno de los pocos órganos que tiene la capacidad para sanar completamente sin dejar cicatriz, hay casos en que el proceso falla ^3,4. Dependiendo de las circunstancias y la calidad del tratamiento, 30.2% de las fracturas de huesos largos fallar, lo que resulta en la no unión ^3,5. Si bien sigue habiendo cierto debate sobre la definición, pseudoartrosis, lesiones óseas críticos de tamaño o no sindicalizados generalmente se refiere a una lesión que no sana durante toda la vida natural de la materia ^6. Para fines experimentales, esta duración se acorta el tiempo promedio requerido para la curación completa de una lesión de tamaño medio hueso. Lesiones óseas no sindicalizados se producen por numrazones erous, pero los principales factores incluyen trauma extremo que resulta en una brecha crítica de tamaño, infección, mala angiogénesis, el consumo de tabaco, o la capacidad de regeneración ósea inhibida debido a la enfermedad o la edad ^{de 7} años. Incluso si no uniones son tratados con éxito, puede costar más de $ 60,000 por procedimiento, dependiendo del tipo de lesión y los enfoques utilizados ^8.

En casos moderados, se emplea un injerto óseo autólogo. Esta estrategia implica la recuperación del hueso de un sitio donante y la implantación en el sitio de la lesión. Si bien este enfoque es extremadamente eficaz, el volumen de hueso derivado del donante disponible es limitada y el procedimiento implica una cirugía adicional, que se traduce en dolor persistente en muchos pacientes ^9,10. Además, la eficacia del injerto de hueso autólogo es dependiente de la salud del paciente. Los sustitutos óseos fabricados con materiales sintéticos o hueso de cadáver procesados ​​son abundantemente disponibles ^11-13, pero HÃve limitaciones significativas, incluyendo las propiedades pobres de adhesión de la célula huésped, la reducción de osteoconductividad, y el potencial para el rechazo inmune ^14. Por tanto, existe una necesidad urgente de tecnologías de regeneración ósea que son seguros, eficaces y ampliamente disponibles.

Nuestra capacidad para mejorar las estrategias de regeneración de hueso depende fundamentalmente de la capacidad de imitar traumatismo óseo grave en animales de laboratorio, pero la generación y la estabilización de las lesiones óseas grandes es técnicamente difícil. En la mayoría de los casos, grave trauma hueso largo es imitado experimentalmente mediante el establecimiento de un defecto que no se cura de forma natural. Aunque puede variar con la especie ^15, esto se logra mediante la eliminación completa de un segmento de hueso que es mayor que 1,5 veces el diámetro de la sección transversal del hueso ^16. El hueso se estabiliza luego con un implante metálico para mantener la orientación correcta de los bordes de la fractura y permitir la movilidad. Debido a su pequeño tamaño y la fragilidad desus huesos largos, el establecimiento de este tipo de lesiones en los ratones están más allá de las capacidades de la mayoría de los grupos de investigación. Como tal, los modelos de defectos de huesos largos se limitan a ratas y animales más grandes. Sin embargo, los ratones ofrecen ventajas significativas en investigación que pueden ser modificados y criados como cepas inmunocomprometidos que no rechazan las células y tejidos humanos genéticamente.

Para las aplicaciones basadas en células humanas, los ratones inmunodeprimidos son atractivas para trabajar con ellos porque son fisiológicamente bien caracterizados, fácil de casa, rentables y de fácil analizaron radiográfica como microscópicamente. De suma importancia es que los ratones inmunodeprimidos no rechazan las células de diferentes especies, incluyendo los seres humanos. Su pequeño tamaño también permite el ensayo de un número muy pequeño de células o volúmenes de andamios experimentales en aplicaciones ortopédicas. Se han descrito varios modelos murinos ortopédicos que permitirse diversos grados de estabilidad ósea ^17,18. Aquellos systems que resultan en niveles muy altos de estabilidad, tales como fijadores externos y las placas de bloqueo se curan predominantemente por la osificación endocondral intramembranous aunque la curación ha sido reportado ^19. Por el contrario, las que permiten algunos micro y / o macro-movimiento, como las que emplean pasadores medulares no fijadas o parcialmente fijos, por lo general se curan con un predominio de la osificación endocondral ^20,21. Unión retardada o defectos no sindicalizados de los huesos largos son particularmente difíciles de lograr en los ratones debido al nivel adicional de estabilización requerida. Sin embargo, se ha informado de una serie de enfoques, incluyendo pasadores medulares con clavos entrelazados, placas de bloqueo y fijadores externos ^22. Estos sistemas generalmente funcionan bien, pero teniendo en cuenta su diseño complicado que puede ser técnicamente difícil de instalar. Por ejemplo, García et al. ²³ ideó un sistema de pasador de enclavamiento elegante para su uso en ratones, pero el procedimiento implica incisiones en dos sitios separadoss y una amplia modificación del fémur para acomodar los pasadores. Estos procedimientos se realizaron bajo un microscopio de disección.

En este documento, se describe un sencillo pasador medular femoral con un collar central diseñado para evitar el cierre de un déficit óseo 3 mm y también delinear los bordes originales del defecto. Mientras que el pasador no se fija en el hueso, el tamaño preciso de pasador y el diámetro de escariado de los resultados cavidad medular en la interferencia suficiente para minimizar el movimiento de torsión (Figura 1). Con una cuidadosa selección de edad endogámica, género y ratones de la cepa emparejados, el resultado es un no-uniondefect hipertrófica altamente reproducible ²² que puede ser fácilmente evaluada radiológicamente. Además regiones de interés pueden ser definidos de forma reproducible después de micro-tomografía computarizada (μCT) para la medición de la formación de hueso de novo y los parámetros histomorphological. Los pasadores se prototipos en nuestro laboratorio utilizando herramientas disponibles.

Figura 1: Principio Experimental resumen esquemática del modelo de defecto segmentario.. El segmento central 3 mm de un fémur murino 9-10 mm se extirpa quirúrgicamente (izquierda). Un tubo de acero quirúrgico de calibre 19 de 3 mm de largo se pasa más de un 9 mm de largo, 22 G tubo de acero inoxidable y se fija con adhesivo en el centro exacto (derecha). El pasador resultante se encaja en los canales medulares de las porciones proximal y distal restantes del fémur con el collar 19 G sustituyendo el segmento de 3 mm de hueso (por debajo de, centro).

Protocol

NOTA: Este protocolo está diseñado para (Nu / J) ratones desnudos hembra (18-25 g, 6 semanas) adquiridos de Jackson Laboratories. Desde cepas de ratones varían ligeramente en función de la anatomía y la tasa de crecimiento, le aconsejamos que la fabricación de pasadores está optimizada para la cepa, el sexo y la edad de los destinatarios antes de su implantación en sujetos vivos. Si las cepas se seleccionan cuidadosamente, el ajuste de interferencia entre el pasador y la cavidad ósea es altamente reproducible. …

Representative Results

Los ratones se recuperan la conciencia y de las extremidades posteriores movilidad 5-10 minutos después de la retirada de la anestesia. Durante los primeros 5 días, es aconsejable para albergar a los ratones individualmente e introducir el enriquecimiento ambiental para evitar el exceso de uso de la extremidad. Para este propósito, los nidos de tipo iglú reducen la necesidad de la construcción del nido y animan descanso. También hemos observado que la provisión de alimentos y de hidrogel en el suelo de la jaula r…

Discussion

En este documento, se describe un método simple para generar un defecto crítico tamaño pin-estabilizada del fémur murino utilizando estándar de laboratorio y equipo veterinario. Mientras que el montaje de los pasadores y el procedimiento quirúrgico en sí mismo requiere práctica, está dentro de las capacidades de un científico de investigación biomédica bien entrenado o veterinario.

El pasador se coloca en el canal medular sin fijación adicional, haciendo que el procedimiento té…

Materials

Name of Equipment/Material*	Company	Catalog or model	Notes
Pin Assembly
Dremel rotary tool	Dremel	8220	or equivalent
Heavy duty cut off wheel	Dremel	420
Surgical tubing 19G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8LY	OD 1.07mm, ID 0.889mm
Surgical tubing 21G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8YQ	OD 0.82mm, ID 0.635mm
Surgical tubing 22G	Small Parts (Amazon)	B000FMYLZS	OD 0.719mm, ID 0.502mm
Surgical tubing 23G	Small Parts (Amazon)	B000FN0SY0	OD 0.643mm, ID 0.444mm
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882
Emery disc	Dremel	413
Rubber polishing point	Dremel	462
Felt polishing disc	Dremel	414
Gelatin sponge	Surgifoam/Ethicon	1974
Punch biopsy cutter	Miltex	33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray	Steris	1429-77
Bead sterilizer	Germinator/CellPoint Scentific	Germinator 500
Anesthesia system	VetEquip Inc	901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic	VETone/MWI	501017, 502017
Surgical disinfectant	Chloraprep/CareFusion	260449
Surgical tools	Fine Science Tools	various	recommend German made
Face protection	Splash Shield	4505
Rechargable high speed drill	Fine Science Tools	18000-17
Diamond cutting wheel	Strauss Diaiond	361.514.080HP
Absorbable sutures	Covidien	UM-213
Outer sutures	Ethicon	668G	or equivalent
Vetbond	3M	1469SB	or equivalent
Hydration gel	Clear H2O	70-01-1082
Diet gel	Clear H2O	72-01-1062
Buprenorphine	Reckitt and Benckser	12496-0757-01	controlled substance
Mouse igloos	Bio Serv	K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail	Euthasol/Virbac	710101	controlled substance
Analysis
Live animal imager	Orthoscan	FD Pulse	or equivalent
Micro-CT unit and software	Bruker	Skyscan1174	or equivalent
Sealing film/Parafilm M	VWR or Fisher	100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.