Preparazione cellule aderenti per X-ray Fluorescence Imaging da Chemical Fixation

Summary

Qui, presentiamo un protocollo su come determinare la quantità e la distribuzione dei metalli in un campione utilizzando la fluorescenza a raggi X di sincrotrone. Ci concentriamo sulle cellule aderenti e descriviamo il metodo di fissazione chimica per preparare questo campione. Descriviamo quindi come montare e visualizzare il campione utilizzando i raggi X di sincrotrone.

Abstract

L'imaging a fluorescenza a raggi X ci consente di misurare in modo non distruttivo la distribuzione spaziale e la concentrazione di più elementi contemporaneamente su aree di campionamento grandi o piccole. È stato applicato in molte aree della scienza, tra cui la scienza dei materiali, le geoscienze, lo studio delle opere del patrimonio culturale e la biologia chimica. Nel caso della biologia chimica, ad esempio, la visualizzazione delle distribuzioni dei metalli all'interno delle cellule ci permette di studiare sia gli ioni metallici presenti naturalmente nelle cellule, sia i metalli introdotti esogenamente come farmaci e nanoparticelle. A causa della natura completamente idratata di quasi tutti i campioni biologici, la criofissazione seguita dall'imaging a temperatura criogenica rappresenta la modalità di imaging ideale attualmente disponibile. Tuttavia, nelle circostanze in cui tale combinazione non è facilmente accessibile o pratica, la fissazione chimica a base di aldeidi rimane utile e talvolta inevitabile. Questo articolo descrive nel modo più dettagliato possibile la preparazione di cellule di mammifero aderenti mediante fissazione chimica per l'imaging fluorescente a raggi X.

Introduction

X-ray fluorescenza consente sia l'identità e la quantità di elementi presenti in un campione da spazialmente risolto. Incidente raggi X, di una energia selezionata per essere maggiore dell'energia dell'elemento più pesante di interesse vincolante elettroni, superare l'energia di legame degli elettroni interno-shell al nucleo ^1. Questo crea un 'buco' nel guscio di elettroni. Come elettroni ad alta energia cadono in questi fori, raggi X fluorescenti sono emessi cui lunghezza d'onda dipende dalla separazione dell'energia di tali orbitali. Poiché la spaziatura energia degli orbitali è caratteristica di un dato elemento, l'em....

Protocol

1. Preparazione di strumenti, Substrati, Culture Media e Piatti

1. Gestione delle finestre nitruro di silicio (Si ₃ N _4).
   1. Aprire la capsula leggermente spremitura un'estremità contenente la finestra in modo tale da non comprimere finestra stessa, ruotando l'altra estremità della capsula con l'altra mano.
   2. Controllare un paio di inversione, pinzette dalla punta sottile sotto stereomicroscopio per assicurarsi che non ci siano adesivi, lacune o curve sulla punta. In caso contrario, le finestre possono essere rotti dalle pinzette o il distacco di loro durante le fasi successive.
   3. Rimuovere la finestra d....

Results

La capacità dell'imaging fluorescenza a raggi X per fornire informazioni sui campioni biologici è subordinato questi campioni essere preparati in modo tale che essi sono robusti alle radiazioni sulla scala temporale dell'esperimento, e tuttavia la loro caratteristiche chimiche e strutturali sono ben conservato. Nella visualizzazione del risultato di un campione che è stato preparato come sopra descritto e illustrato, è possibile vedere che c'è variazione degli elementi presenti - indica che la fissazione conservato ques.......

Discussion

X-ray imaging di fluorescenza è utile in molti campi, tra cui geoscienze, scienza dei materiali e biologia chimica ^26-34. Advances in raggi X di sincrotrone, e la loro messa a fuoco, hanno prodotto molto fasci ad alta intensità. Focused X-ray travi sufficiente per eccitare i metalli endogeni nelle cellule ora esistono, segnale che può essere misurata con la tecnologia attualmente disponibile rivelatore al silicio deriva produzione. E studio della biologia chimica di metalli nella cella è un'applicazione i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Finestre in nitruro di silicio	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, Regno Unito	SiRN-5.0-200-2.0-200. Ordina per taglia. Dimensioni della membrana: 1,5 mm x 1,5 mm. Spessore: 200  Nm. Dimensioni del telaio: 5  mm x 5 mm. Spessore del telaio: 200 µm.	Fonte alternativa: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Pinzetta inversa Microscopia	elettronica Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Numero verde: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Pinzette ultra fini
Tappetino a griglia in gomma	Microscopia elettronica Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Numero verde: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Tappetino a griglia rotonda
Acido acetico	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	di acido acetico
TUBI per metalli	in tracceSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	tampone solid PIPES
Soluzione madre di formaldeide	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Numero verde: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 fiale da 10 ml di paraformaldeide acquosa al 20%