Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus
Summary
We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.
Abstract
Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.
Introduction
Dynamische Veränderungen in der Anzahl und Struktur der Synapsen sind die Markenzeichen der Entwicklung, Alterung, und zahlreiche neurodegenerative Erkrankungen 1-3. Die Fähigkeit der Neuronen synaptische Informationen zu erhalten und zu integrieren, hängt von dendritischen Morphologie und dynamische Veränderungen synaptischer Verbindungen. Tatsächlich existiert eine positive Korrelation zwischen dendritischen Dorn und Synapsen Nummer, die sowohl die kognitiven Funktionen beeinflussen 4. So ist es nicht verwunderlich, dass Verringerungen in dendritischen Dorn Nummer haben mit kognitiven Störungen in einer Reihe von neurologischen Erkrankungen 5-7 in Verbindung gebracht, woraufhin ein großes Interesse an dendritischen Dorn Quantifizierung. Dennoch ist die Quantifizierung der Wirbelsäule Dichte bleibt eine zeitaufwendige und mühsame Aufgabe, die nützliche Informationen über die Topographie und die Verteilung von Synapsen auf der Dendritenbaum erzeugen ausfällt. Glücklicherweise Färbemethoden (zB Golgi-Cox und Double (DCX)) in Verbindungmit hoch entwickelten bildgebenden Verfahren kann eingesetzt werden, um Strombarrieren überwinden und hochaufgelöste Bilder von dendritischen Verzweigung in einem zuverlässigen und schnellen Weise. Während Golgi-Cox-Färbung eingesetzt werden kann, um den Zustand der dendritischen Verzweigung in allen Neuronen 8 beurteilen können DCX eingesetzt werden, um neugeborene Neuronen besonders im Gyrus dentatus und Subventrikularzone 9, eine wichtige Überlegung beschriften da die Neurogenese in beiden auftritt diese Regionen in der gesamten Lebensspanne 10,11.
Nach der Färbung wurden zwei bildgebenden Verfahren eingesetzt werden, um dendritischen Eigenschaften zu bewerten: i) Echtzeit-Bildgebung (RTI) und ii) erweitert Schärfentiefe-Bildgebung (EDFI). Die FTI-Technik liefert eine mittlere zu verfolgen und zu quantifizieren, die Länge und die Reihenfolge der Verzweigung entlang der einzelnen dendritischen Segmente und Branchen. So ermöglicht sie es, die gesamte Fläche und Volumen von jedem dendritischen Baum besetzt schätzen. Mehr specifically im RTI Verfahren der Benutzer kontinuierlich identifiziert die Segmente und refokussiert iterativ das Neuron Spursoftware speichert die x, y und z-Koordinaten der dendritischen Struktur und rekonstruiert die Trajektorie der dendritische Struktur in 3D. Im Vergleich dazu bietet die EDFI-Methode eine ziemlich einfache und beschleunigten Mittel zur Bewertung dendritischen Dichte in ziemlich dicken Gewebeproben durch die Erzeugung eines zusammengesetzten Bildes, die Informationen über den gesamten Z-Achse. Dazu zeichnet der Anwender High-Definition-Video-Dateien über die Dicke des Abschnitts, und dann nutzt Software zu suchen, die Video-Frames, um Punkte zu identifizieren, wobei ein Pixel vollständig im Fokus. Anschließend werden die fokussierten Pixel zusammengeführt und in eine hochauflösende Bildverbund 2D integriert. Dieses zusammengesetzte Bild enthält alle Pixel, die In-Fokus unabhängig von ihrer Position in der z-Achse sind. Qualitative und quantitative Analyse dieser 2D-Bilder können anschließend verwendet werden, um die Dichte zu bestimmen,der dendritischen Verzweigungen in jedem Feld.
Schließlich stellen wir ein Verfahren zum Erzeugen von Panorama extrem hochauflösende Bilder für die Analyse und Bewertung von Dendriten in einem gesamten Bereich von Interesse. Diese Technik kann eingesetzt werden, um den mangelnden Zugang zu sehr hochauflösende und teure Digitalkameras überwinden. Mit dieser Methode, eine fängt Serienbilder an verschiedenen Orten entlang der x- und y-Achsen und automatisch Stiche sie zusammen mit einer Freeware (zB Image Composite Editor). Bemerkenswerterweise kann dieses Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse der dendritischen Verzweigung nicht in einem weiten Bereich verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wurden zwei Methoden beschrieben, um das Ausmaß der dendritischen Verzweigung in reifen und neugeborenen Neuronen mit herkömmlichen Färbemethoden in Verbindung mit RTI und EDFI quantifizieren. Die Übernahme von hochauflösenden Bildern von Neuronen ein extrem nützliches Verfahren zum Testen der schädlichen Wirkungen von neurodegenerativen Erkrankungen und wiederum stellt ein Mittel zur therapeutischen Strategien, Hippocampusneuronen Ziel beurteilen.
Während die RTI-Methode wurde …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer’s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified Golgi-cox staining solution | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 1x Developing Solution (Stock 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 30% Sucrose, | Sigma | CAS # 57-50-1 | make fresh in ddH2O |
| 0.3% Gelatin | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xylene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medium | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) white | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4 C |
| DAB | Sigma | CAS Number 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | CAS Number 77-86-1 | NA |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Digital Camera | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 bit Camera | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida System | MBF Bioscience | V.10 | |
| Image Composite Editor | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | Versin 7.00 |
Riferimenti
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