Ansikts Nerve aksotomi i Mus: En modell for å studere Motoneuron Response to Injury

Summary

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Abstract

Målet med dette kirurgisk protokollen er å eksponere ansikts nerve, som innervates ansiktsmuskulaturen, på sin exit fra stylomastoid foramen og klippet ut eller knuse det å indusere perifer nerveskade. Fordeler med denne operasjonen er dens enkelhet, høy reproduserbarhet, og mangel på effekt på vitale funksjoner eller mobilitet fra den etterfølgende ansiktslammelse, noe som resulterer i et relativt mildt kirurgisk resultat sammenlignet med andre nerveskade modeller. En stor fordel med å bruke en hjernenerve skade modellen er at de motoneurons bor i en relativt homogen befolkning i ansikts motor kjernen i pons, forenkle studiet av motoneuron celle organer. På grunn av den symmetriske natur av ansiktsnerven innervasjon og mangel på krysstale mellom ansiktsmotor kjerner, kan operasjonen utføres ensidig med unaxotomized side tjener som en sammenkoblet intern kontroll. En rekke analyser kan utføres postoperativt for å asseser den fysiologiske reaksjon, detaljer som er utenfor omfanget av denne artikkelen. For eksempel, kan utvinning av muskelfunksjon tjene som en markør for atferds reinnervation, eller motoneurons kan kvantifiseres for å måle celleoverlevelse. I tillegg kan de motoneurons være nøyaktig fanget ved hjelp av laser mikrodisseksjon for molekylær analyse. Fordi ansikts nerve aksotomi er minimal invasiv og godt tolerert, kan det brukes på et bredt utvalg av genmodifiserte mus. Dessuten kan denne operasjonen modellen brukes til å analysere effektiviteten av perifer nerveskade behandlinger. Ansikts nerve skade gir et middel for å undersøke ikke bare motoneurons, men også svarene i det sentrale og perifere glial mikromiljøet, immunsystem, og målet muskulatur. Ansikts nerve skade modellen er en allment akseptert perifer nerveskade modell som fungerer som et kraftig verktøy for å studere nerveskader og regenerering.

Introduction

Mange perifer nerveskade modeller finnes, men en som skiller seg ut for studiet av motoneurons er ansikts nerve aksotomi modell. Ansikts nerve, også kjent som hjernenerve VII, stammer i pons og innervates muskler av ansiktsuttrykk ^1,2. I denne kirurgiske protokollen, er ansikts nerve eksponert på sin exit fra stylomastoid foramen og klippet ut eller knust. Alvorlighetsgraden av nerveskade kan klassifiseres følge Sunderland ^tre klassifikasjoner, som skiller skaden basert på intactness av aksoner, endoneurium, perineurium, og epineurium, som er bindevev lag som sekvensielt festes rundt aksonet bunter. I knusningsskade (axonotmesis), blir aksoner kuttet, men perineurium og epineurium er bevart. Komplett funksjonell utvinning fra ansikts nerve knuse skjer i ca 11 dager fordi intakt nerve slire fungerer som en kanal innen hvilke aksoner regrow ^4,5. PåDerimot, i snitt skade (neurotmesis), aksonene og alle 3 bindevevslagene adskilles, og hele distale nerve må vokse for å gjenopprette muskulatur innervasjon. Kirurgisk gjeninnkobling av epineurium er ofte utført i menneskelige pasienter med nervetran skader, men gjenopprettings utfall er sjelden optimal. Videre studier er nødvendig for å forstå hvorfor nerve unnlater å vokse til målet, og hvilke behandlinger kan anvendes for å forbedre og påskynde regenerativ prosess.

Det er mange fordeler med å studere nerveskader ved bruk av ansiktsnerven aksotomi modell. Først er det ansikts nerve aksotomi prosedyre rask, enkel og svært reproduserbare; og den resulterende lammelse av ansiktsmusklene ikke påvirker vitale funksjoner og er godt tolerert av dyret. Fordi dette er en hjernenerve skade modell, studere motoneuron celle organer er forenklet fordi motoneurons bor i en relativt homogen befolkning i the ansikts motor kjernen i pons. Befolkningen skiller basert på subnuclear mønster i ansikts motor kjernen, som det er syv subnuclei hver enkelt å innervating en bestemt gruppe av muskler, så subnuclear forskjeller i respons til aksotomi kan påvirke resultatene ^2,6,7.

En stor fordel med ansikts nerve skade modellen er at den unaxotomized side kan tjene som en sammenkoblet internkontroll fordi nerve innervasjon er svært symmetrisk og det er ingen crosstalk mellom ansiktsmotorkjerner ^8. En annen fordel ved å bruke denne kirurgisk metode er mangelen på direkte skade på sentralnervesystemet eller forstyrrelse av blod-hjerne barrieren ^9. Komplikasjoner som store blødninger og infeksjoner er sjeldne med denne prosedyren.

En rekke analyser kan utføres for å evaluere den fysiologiske reaksjon på nerveskade. Gjenvinningen av øyet blunkerefleksen og whisker-aktivitet kan anvendes som et adferdsmål på funksjonell utvinning ^10,11. Videoopptak av vibrissae aktivitet er i dag den mest effektive metoden for å oppdage utvinning av ansikts nerve innervation ^12,13. Etter eutanasi, kan histologisk analyse av hjernestammen utføres på motoneuron cellelegemer innen ansiktsmotorkjernen. Ansikts motor kjernen er delt inn i sju subnuclei, hver spesifikke for visse ansiktsmusklene, slik at for differensial undersøkelse av svarene til skade ^2,6. Ansikts motoneurons kan telles for å kvantifisere celleoverlevelse, eller immunohistokjemi kan brukes til å identifisere biomarkører og spesifikke cellepopulasjoner ^14. Ansikts motor kjernen kan være nøyaktig microdissected ved hjelp av laserskanning for molekylær analyse av cellulær respons til nerveskade ^15,16. Konsekvenser av ansikts nerve aksotomi kan analyseres i motor cortex ^17,18. Dessuten kan nerve bli dissekert å studere Wallerian degenerasjon ¹⁹ elleraxon regenerering ^20, og musklene kan fjernes for å studere nevromuskulære veikryss ^21. Ansikts nerve aksotomi kan også brukes til å studere vedlagte sentrale og perifere gliaceller ^22, målrette muskulatur ^21, og immunsystemet ^23. Selv om mye er oppnådd i å studere ansiktsnerven aksotomi modell ^24, er videre studier av perifer nerveskade nødvendig fordi nerveskader er et betydelig problem for pasienter og nåværende behandlinger mislykkes å produsere optimale resultater. Denne modellen er et kraftig verktøy for å undersøke den fysiologiske respons på nerveskade og analysere effektiviteten av nerve regenerering terapier.

Protocol

Alle prosedyrer som utføres er godkjent av Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care og bruk komité og følge National Institute of Health retningslinjer. 1. kirurgisk teknikk Opprettholde aseptisk teknikk under denne prosedyren ved hjelp av sterile hansker, instrumenter og en steril kirurgiske feltet ifølge NIH retningslinjer 25. Sterilisere verktøy før du starter kirurgi ved autoklave dem (se tabell over spesifikke reagenser / Utstyr…

Representative Results

Etter at ansiktsnerven aksotomi utføres, skjer motoneuron tap som et resultat av skaden. Motoneuron overlevelse etter skade avhenger av mange variabler, som kjønn, alder på dyr på tidspunktet for kirurgi, og den endepunktet hvor de motoneuron teller er ferdig, og Moran og Graeber gjennomgang 24 og Jinno og Yamada gjennomgang 22 både oppsummere motoneuron overlevelsesdata. Vanligvis ca 86% av motoneurons overleve 28 dager etter aksotomi 14,15,26. Kinetikken for motoneuron tap er besk…

Discussion

The critical step for this protocol is positioning the mouse properly before surgery is begun. If the mouse is not lying flat on its side, the ear is not taped at the correct angle, or the incision is made in an incorrect location, then finding the facial nerve becomes much more difficult. When this technique is mastered, surgeries will take only minutes per mouse.

Either sutures, glue, or wound clips can be used to close the wound. Wound clips are preferred because of the small size of incis…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Stereo Microscope	Leica	M60
Labeling tape	Fisher Scientific	15-952
Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5cm/5mm cutting edge	Fine Science Tools	15003-08	Sterilize before use
Dumont #5/45 Forceps – Standard tips/Angled 45°/Dumoxel/11cm	Fine Science Tools	11251-35	Sterilize before use
Michel Suture Clips – 7.5mm x 1.75 mm	Fine Science Tools	12040-01	Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use
Hagenbarth Cross Action Wound Clip Applier 5"	George Tiemann & Co	160-910	Used to apply wound clip, sterilize before use
Michel Suture Clip Applicator & Remover – For 7.5 mm Clips	Fine Science Tools	12029-12	Used to remove wound clip
0.9% Sodium Chloride Injection, USP	Hospira	0409-4888-10
Betadine, 16 oz, with dispenser	Fisher Scientific	19-027132
70% Ethanol
Glass Bead Sterilizer